第一章 锌转运蛋白 6（ZnT6）在小鼠附睾组织和精子中的定位和表达
1.1 实验材料
1.1.1 实验试剂
医学论文参考
1.2 实验方法
1.2.1 RNA 抽提
脊椎脱臼法处死 10-12 周龄 C57 小鼠，无菌操作下分别取肝、脾、肺、脑、附睾（头、尾）、睾丸、骨骼肌、精囊、小肠部分组织,实验步骤如下（Trizol 法）：
1. 将各组织放入电动匀浆器中，加入适量 Trizol 裂解液（每 50-100mg 组织加 1mL Trizol 裂解液），充分匀浆。
2. 匀浆液移入新的 1.5mL EP 管中，静置 5min 后 4℃，12000Xg 离心 10min。
3. 取上清移入新的 1.5mL EP 管中，加入氯仿（每 1mLTrizol 裂解液加 200μL 氯仿），剧烈震荡 15s，室温下静置 5-10min 后 4℃，12000Xg 离心 10min。
4. 将上层水相移入新的 1.5mL EP 管中，加入异丙醇（每 1mL Trizol 裂解液加500μL 异丙醇）并颠倒混匀，室温静置 10min 后 4℃，12000Xg 离心 10min。
5. 弃去上清液，用 75%的乙醇洗涤沉淀（1mLTrizol 裂解液加 1mL 的 75%乙醇）并震荡，4℃ 7500Xg 离心 5min。
6. 弃去上清液，室温下晾干沉淀，溶于 DEPC 处理过的无酶纯水中，即为目的总 RNA。
7. 利用核酸测定仪检测 RNA 的浓度和 A260/A280 值。 8. 配制 1%琼脂糖凝胶，去 2μL RNA 上样电泳。
1.2.2 RT-PCR
将所提取的各器官组织 RNA 进行逆转录：
1. 逆转录体系：模板 RNA5.0μL，5×gDNA digester Buffer 2μL，gDNA digester 1μL，RNase free ddH2O 2μL，42℃ 孵育 2min 后取上述反应液 10μL，加入 2×Hifair®ⅡsuperMix plus 10μL 总反应体系为 20μL。
2. 反应程序如下：25℃ 5min，42℃ 30min，85℃ 5min，即得模板 cDNA。
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第二章 ZnT 6 在肥胖小鼠附睾组织和精子中的差异性表达
2.1 实验材料
2.1.1 实验试剂
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2.2 实验方法
2.2.1 高脂饮食诱导肥胖小鼠模型的构建
共选择 30 只 C57BL / 6 雄性小鼠（4 周龄）进行实验。 在整个研究过程中，小鼠随机分为正常（n=10，共 2 笼）和肥胖组（n=20，共 4 笼）。 正常组的小鼠接受标准对照饲料喂养，每周每笼固定投喂 200g 标准对照饲料，记录每周的食物摄入量和体重。 肥胖组的小鼠接受高脂饲料喂养，每周每笼固定投喂 200g高脂饲料。 所有小鼠均饮用自来水并在标准条件（光照/黑暗周期：每天 12/12小时，温度：22±2°C，湿度：40％-50％）饲养 10 周，然后将喂食高脂饮食组小鼠放入肥胖组（HDF），喂食标准饮食组小鼠放入正常对照组（CD）。
2.2.2 肥胖小鼠模型的鉴定
我们将此三个方面对高脂饮食诱导的肥胖小鼠进行鉴定，首先，我们将在每周对小鼠的体重和饲料消耗量进行检测；其次眼球取血法取得两组小鼠全血，静置 30min 后，1000xg离心 10min，取两组小鼠血清并对血清中的甘油三酯（TG），血清总胆固醇（TC），低密度脂蛋白（LDL），高密度脂蛋白（HDL）进行检测；最后取出两组小鼠肝脏，经切片后观察两组小鼠肝脏 HE 染色结果。部分结果经 SPSS 18.0 软件进行 ONE WAY ANOVA 方法分析，P＜0.05 存在统计学意义。
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第三章 ZnT6 蛋白在弱精子症患者中的差异化表达 ........................ 35
引言 ....................................... 35
3.1 实验材料 ........................... 35
3.1.1 实验试剂 ................................. 35
3.1.2 主要仪器 ........................ 36
结论................ 43
第三章 ZnT 6 蛋白在弱精子症患者中的差异化表达
3.1 实验方法
3.1.1 实验分组与统计
从大理大学第一附属医院生殖医学科获得的精液样本依照常规精液检查结果和患者体重 BMI 指数进行分类。患者体质分类依照中国 BMI 参考标准分为正常：18.5≤BMI＜24；超重：BMI≥24；肥胖：BMI≥28。根据 UNDP/UNFPA/WHO/ 世界银行人类生殖研究、发展和研究培训特别规划署及 WHO 人类生殖健康与研究部共同在 2018 年拟定的第五版 WHO 人类精液检验与处理实验手册中标准将患者精子活力分为：A 级精子表示精子快速直线前向运动，直线运动；B 级精子表示精子缓慢或呆滞向前运动，缓慢运动；C 级精子表示精子非向前运动，原地运动；D 级表示精子不能活动，不运动；且生育力正常有活力精子应在 70%以上，若活力低于 50%则为异常，同时规定精液参数中前向运动的精子(A 和 B 级)小于50%或 A 级运动的精子小于 25%可定义为弱精子；正常形态精子比例小于 35%则符合畸形精子症。对数据使用 SPSS18.0 软件进行 One Way ANOVA 分析，P＜0.05，具有统计学意义。
3.1.2人精子精浆分离
1. 取出-80℃保存的精液样本，37℃水浴锅 3-5 分钟解冻。
2. 800Xg 离心 15min，吸取上清即为精浆样本，-80 保存。
3. 离心管底沉淀加入 PBS，移液枪吹打混匀，800Xg 离心 10min，以上操作重复三次洗涤
4. 洗涤完成后，管底白色沉淀即为精子样本。
5. 精子样本中加入适量台氏液重悬，显微镜下计数调整浓度。
6. 将调整浓度后的精子滴在载玻片上适当位置，37℃烘箱烘干后，浸入入 4%多聚甲醛中固定 15min，室温晾干后-80 摄氏度保存备用。
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结论
1. 通过实时荧光定量 PCR 技术检测各组织中各 ZnT 基因相对表达情况，发现 ZnT各成员的表达具有差异性，其中附睾中 ZnT6 表达量较高，且附睾头部和附睾尾部中 ZnT6 的表达差异明显。
2. 运用免疫荧光检测了 ZnT6 蛋白在正常小鼠附睾头部和尾部以及附睾头、尾部精子中定位及表达的变化，发现 ZnT6 在附睾中主要集中表达在附睾上皮细胞内且在近管腔侧表达明显，而在精子的颈段和中段表达较高，进一步分析发现正常小鼠体内附睾头部、尾部中 ZnT6 表达从头部到尾部是逐渐增高的同时 ZnT6 在附睾尾部精子中的表达也高于附睾头部的精子。附睾头部和尾部的蛋白免疫印迹的结果和间接免疫荧光的结果是一致的。
3. 高脂饲料诱导的肥胖小鼠附睾头部和尾部的 ZnT6 的蛋白表达均是下降的，并且和正常小鼠附睾尾部的精子相比高脂饲料诱导的肥胖小鼠附睾尾部精子中 ZnT6 的表达也是减弱的，说明 ZnT6 与肥胖导致的氧化应激损伤间成负相关关系。
4. 收集人精液样本分为弱精子症样本和正常样本，运用免疫荧光技术检测人精子 ZnT6 表达变化，蛋白免疫印迹检测人精浆中 ZnT6 的表达，结果显示弱精子症患者精子中的 ZnT6 表达量显著低于正常样本且肥胖致弱精子症患者精浆中的 ZnT6 也是降低的，说明人 ZnT6 的表达与人氧化应激损伤呈负相关关系。
参考文献（略）