【摘要】 目的 探讨细胞外信号调节蛋白激酶ERK在乳腺癌组织中的表达、临床意义及其与bFGF蛋白的关系。方法 应用免疫组织化学SP法检测90例乳腺癌，10例乳腺癌旁组织和15例乳腺良性病变中ERK和bFGF蛋白的表达情况。结果 ERK1/2和bFGF蛋白在浸润性乳腺癌组阳性表达率分别为81.1% 和62.2%，与癌旁组织和乳腺良性病变比较，差异有显著性(P&<0.05)。ERK蛋白阳性表达与乳腺癌的临床分期有关，有腋窝淋巴结转移者的阳性表达高于无转移者，经统计学处理，差异有显著性(P&<0.05)。bFGF，ERK蛋白阳性表达与乳腺癌的肿瘤直径、组织学类型状态、组织学分级无关(P&>0.05)。结论 ERK蛋白在乳腺癌组织中表达上调，且与病理分期有关，提示其可能在乳腺癌发生、发展中起重要作用，ERK可能成为乳腺癌治疗中的一个靶基因，ERK与bFGF蛋白可能在乳腺癌的演进中起着协同作用。
【关键词】 ERK;bFGF;免疫组化;乳腺癌
Abstract：Objective To study the expressions in primary breast carcinomas， clinic significance of ERK and the relationship between it and bFGF protein as well.Methods The expression of ERK and bFGF protein was studied in 90 breast carcinoma samples， 10 breast benign lesions samples as well as 15 adjacent normal tissues by SP inmmunohistochemical (IHC) analysis.Results The positive rates for ERK and bFGF expression were 81.1% and 62.2% respectively in breast cancer tissues， and there was obvious difference when compared with cancer adjacent normal tissues and breast benign lesion. There was no significant difference between the expression of ERK， tumor size， histologic type and histologic grade (P&>0.05). The expression of bFGF protein in breast cancer had nothing to do with tumor size， histologic type and histologic grade (P&>0.05). The protein expression of ERK and bFGF were correlated with each other (P&<0.05) closely. Conclusions The over-expression of ERK in breast cancer tissues was coupled with pathological grade， which indicated it may play an important role in carcinogenesis and progression of breast cancer， and it should be a target gene in therapy of breast cancer. ERK and bFGF may play synergetic roles in the process of carcinogenesis of breast carcinomas.
Key words：ERK;bFGF;IHC;breast carcinomas
丝裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kidnase，MAPK)信号途径在肿瘤的发生发展中起重要作用[1]。MAPK信号转导通路是一条关键的调节细胞增生和凋亡的相关信号转导通路。细胞外信号调节激酶(Extracellular signal-regulated protein kinase，ERK)相关的细胞内信号传导通路被认为是经典的MAPK信号传导途。ERK通路的异常激活，可引起一部分肿瘤表型向恶性转化。与正常乳腺组织和良性肿瘤相比，ERK活性和表达的升高与肿瘤的恶性表型相关[2]。本研究采用免疫组化SP法检测乳腺癌中ERK蛋白的表达，并探讨其与bFGF蛋白的关系，以阐明ERK蛋白在乳腺癌发生发展中的可能作用及临床意义，为乳腺癌的发生发展研究及靶向治疗提供一定的理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 组织样本
115例乳腺病变组织取自辽宁医学院附属第一医院外科2006年7月至2007年7月间手术切除标本。所有标本均经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm连续切片，行HE及免疫组化检测。患者均为女性，年龄为14～77岁，中位年龄46岁，术前均未进行放、化疗及免疫治疗。所有病例均由两位以上病理医师确诊。依据2003年WHO乳腺癌分类标准进行组织学分类：非特殊性浸润性导管癌57例，浸润性小叶癌20例，浸润性特殊性乳腺癌13例;对浸润性非特殊性乳腺癌进行组织学分级：Ⅰ级19例，Ⅱ级24例，Ⅲ级14例。90例浸润性乳腺癌中46例有淋巴转移。根据国际抗癌协会TNM分期方案将乳腺癌分为：Ⅰ期42例，Ⅱ期36例，Ⅲ期12例。另取癌旁乳腺组织10例(距癌边缘5 cm)，乳腺良性病变(乳腺纤维腺瘤及乳腺增生症)15例作对照。
1.1.2 试剂
兔抗人ERK，bFGF多克隆浓缩型抗体购自北京中杉生物科技有限公司，工作浓度为1：100，1：150;浓缩型DAB显色液以及SP染色试剂盒购自福建麦新公司。
1.2 免疫组织化学SP法郭睿，等：ERK与bFGF蛋白在乳腺癌中表达及意义辽宁医学院学报 2008年8月，29(4)
石蜡切片脱腊，脱水，柠檬酸抗原修复对组织抗原进行高压热修复，滴加一抗工作液，4 ℃过夜。顺次滴加生物素标记及辣根酶标记链酶卵白素，DAB显色剂显色，苏木素复染。以0.01 mol/LPBS代替一抗为阴性对照，以已知乳腺癌阳性切片为阳性对照。ERK蛋白阳性表达见于细胞核和(或) 细胞浆。bFGF免疫染色阳性产物呈棕黄色细颗粒状，位于胞浆，胞核或胞膜。二者均以出现明显的棕黄色颗粒为阳性细胞，采用半定量记分法判定，连续观察10个高倍视野(×400)后评价结果，肿瘤细胞以染色强度记分×染色百分比记分，将0～4分定为阴性，4分以上定为阳性。
1.3 统计学分析
采用SPSS12.0软件进行χ2检验，相关分析采用Spearman等级相关方法。
2 结 果
2.1 ERK及bFGF蛋白在乳腺不同组织学类型中的表达
如表1，图1～8所示，90例浸润性乳腺癌组织中，有73例ERK蛋白呈阳性表达，其阳性表达率高达81.1%;而对照的10例癌旁乳腺组织中，无1例蛋白阳性表达;15例乳腺良性病变的阳性表达率也仅为20%。ERK蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率显著高于乳腺癌旁组织及乳腺良性病变组织(P&<0.05)。bFGF蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率为62.2%，明显高于乳腺癌旁组织20%及乳腺良性病变组织的阳性表达26.7%，差异有显著性(P&<0.05)。表1 bFGF、ERK 蛋白在乳腺不同组织学类型中的表达组 注：采用χ2 分割法进行组间比较●为乳腺癌旁组织和乳腺良性病变组织比较，P&>0.05;▲乳腺良性病变组织和乳腺癌比较 ，P&<0.05;■乳腺癌旁组织和乳腺癌比较，P&<0.05
2.2 乳腺癌中bFGF和ERK蛋白阳性表达与临床病理特征之间的关系
如表2所示，bFGF蛋白阳性表达随着临床分期的增加而增高，临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期的阳性表达率分别为30.9%、97.2%、66.6%，有腋窝淋巴结转移者的阳性表达高于无转移者，经统计学处理，差异有显著性(P&<0.05)。bFGF蛋白阳性表达率与肿瘤直径、组织学类型、组织学分级无关(P&>0.05)。
ERK蛋白阳性表达与乳腺癌的临床分期有关。Ⅲ、Ⅱ期ERK蛋白阳性表达率显著高于Ⅰ期，有腋窝淋巴结转移者的阳性表达高于无转移者，经统计学处理，差异有显著性(P&<0.05)。ERK蛋白阳性表达与乳腺癌的肿瘤直径、组织学类型状态、组织学分级无关(P&>0.05)。表2 浸润性乳腺癌中bFGF、ERK蛋白阳性表达与临床病理特征之间的关系临床病理学参数例数
2.3 FGF与ERK蛋白在浸润性乳腺癌中表达的相关性分析
如表3所示，73例ERK蛋白阳性表达的浸润性乳腺癌组织中，bFGF蛋白的阳性表达率为67.1%(49/73);17例ERK蛋白阴性表达组织中，bFGF蛋白的阳性表达率为41.1%(7/17)，差异有显著性(P&<0.05);Spearman相关分析表明二者显著相关(r=0.209，P&<0.05)。表3 浸润性乳腺癌组织中bFGF蛋白 与ERK蛋白表达的相关性bFGFERK+-rP值+4970.2090.048-2410
3 讨 论
bFGF信号转导与肿瘤发生发展的关系极为密切。对于活动性生长的肿瘤来说，bFGF直接作用于肿瘤细胞，促使肿瘤细胞分泌各种蛋白分解酶和胶原酶，从而促进肿瘤转移和浸润。bFGF与靶细胞结合后通过以下途径将信号转至细胞核。(1)激活腺苷酸环化酶与鸟苷酸环化酶;(2)激活磷脂酶C，通过肌醇脂代谢途径产生第二信使(三磷酸肌醇和甘油二酯)，导致蛋白激酶C激活，钙离子内流;(3)与bFGF相关联的酪氨酸激酶活化而发挥作用;(4)bFGF与受体结合后产生配体一受体复合物的内化，即胞吞作用。内化的bFGF大部分被进一步转位至细胞核，影响RNA聚合酶I，加强核蛋白体的转录，以加速细胞由G0期到G1期和G1期到S期的转换，刺激DNA合成增强，促使细胞的分裂与增殖[3]。bFGF与受体结合后通过多条信号转导通路(如PLC/PKC、Ras.Raf.ERK1/2、PI3K/PKB、JAK/STAT等)将信号传人细胞核内。而Ras/Raf/ERK1/2信号转导级联是细胞内重要的信号转导途径[4]，可被生长因子、激素、神经递子等激活 ，参与bFGF调节的许多反应，是许多细胞过程如生长、增殖、分化、存活和恶性转化的调节者。
ERK相关的细胞内信号传导通路被认为是经典的MAPK信号传导途。现已证明多种细胞外信号通过不同的细胞内信号分子和信号通路活化ERK，传统的ERK活化模式可简单的概括为：各种生长因子、激素等→受体→Ras→Raf→MEK→ERK。Ras/Raf/MEK/ERK细胞信号传递通路是一个小GTP蛋白连接活化的受体酪氨酸激酶和胞浆蛋白组成的级联反。此通路的核心是由三种蛋白激酶(MAPKKK，MAPKK，MAPK)构成的白激酶反应链。ERK磷酸化而激活，进入细胞核磷酸化一系列底物[5]。乳腺癌是以上皮细胞基因突变后恶性化克隆形成的，细胞增生分化的生物学效应主要在腺上皮。因此表现为上皮细胞ERK的过度表达或活化。ERK信号转导通路参与了细胞分化和凋亡等多种生物学反应，该通路的活化具有抵抗细胞凋亡的作用。已有学者证实缺氧可通过活化ERK，间接上调实体瘤细胞端粒酶的活性。各种细胞因子等通过ERK生存通路促进细胞存活和抑制细胞程序性死亡。ERK在细胞质内发生磷酸化，进入细胞核后，再磷酸化其下游底物，其中包括原癌基因c-jun，c-myc等编码的转录因子，启动初级和次级应答基因的转录和翻译[6]。其机制可能是以表皮生长因子及其受体等分泌模式改变和活性的增强，增强了对Ras-Raf-MEK-ERK信号传递途径的刺激，持续激活的ERK通路可促进正常细胞向肿瘤表型转化;而抑制ERK信号传导通路，在体外能使肿瘤细胞恢复到非转化的表型，体内则能抑制肿瘤的生长。
研究发现，ERK蛋白在乳腺癌中的表达(81.1%)高于乳腺癌旁组织及良性病变组织.与有腋窝淋巴结转移者的阳性表达高于无转移者，经统计学处理，差异有显著性(P&<0.05)这与Aderinka等[7]研究结果相一致。说明ERK蛋白的高表达与肿瘤的临床分期密切相关，其可以作为判断预后的参考指标之一。
综上所述，bFGF在乳腺癌中呈高表达，其阳性率为62.2%，乳腺癌的肿瘤直径、组织学类型状态、组织学分级无关(P&>0.05)。ERK和bFGF蛋白在乳腺癌中的表达显著相关，提示bFGF可能是通过Ras-Raf-MEK-ERK信号传导通路发生作用，ERK蛋白有望成为乳腺癌治疗的新靶点。
参考文献
[1] Cowley S，Paterson H，Kemp P ，et al.Aetivation of MAP kinase is neessary and suffieient for PC12 differentiation and for transformation of NIH3 cells[J].Cell，1994，77:841-852.
[2] Coutts AS， Murphy LC.Elevated mitogen-activated protein kinase activity in estrogen-nonresponsive human breast cancer cells [J].Cancer Res， 1998，58(18):4071-4074.
[3] Schlessinger J.Cell signaling by receptor tyrosine kinase[J].Cell，2000，103(2)：211-225.
[4] ARBAB1 S，MA1ER RV.Mitogen—activated protein kinase[J].Crit Care Med，2002，30(Supp 1)：74-79.
[5] Qi M，Elion EA.MAP kinase pathways[J].J Cell Sci，2005，118:3569-3572.
[6] Davis R J.The mitogen-activated protein kinsae signal trabsduction pathway[J].Biol Chem，1993，268(5)：14553-14558.
[7] Adeyinka A，Nui Y，Cherlet T，et al.Activated mitogen-activated kinase expression during human breast tumorigenesis and breast cancer Progression[J].Clinical Cancer Research，2002，8:1747-1753.