丹参提取液对HMGB1胞外释放的抑制作用

　　　　作者：王婷婷 徐明，陈国千 王春新 倪芳颖 帅朝霞

【摘要】 　　目的： 研究丹参对内毒素脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）激活后巨噬细胞高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1， HMGB1）释放和内毒素血症小鼠血清HMGB1水平的影响。方法： 使用不同浓度的丹参提取液处理100 ng/ml LPS激活的培养巨噬细胞株RAW 264.7，观察培养上清液中HMGB1水平和细胞HMGB1 mRNA表达的变化，并通过腹腔内注射LPS建立的内毒素血症小鼠模型，观察丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平和存活率的影响。细胞培养上清液和血清HMGB1含量采用酶联免疫分析方法检测，细胞HMGB1 mRNA表达采用RTPCR方法检测。结果： 丹参提取液明显抑制LPS激活后的巨噬细胞HMGB1释放和HMGB1 mRNA表达，降低内毒素血症小鼠血清HMGB1水平并提高存活率。结论： 丹参有抑制巨噬细胞HMGB1释放和保护内毒素血症小鼠的作用。

【关键词】 丹参； 高迁移率族蛋白B1； 巨噬细胞； 内毒素血症

　　［Abstract］Objective: To study the effects of Salvia miltiorrhiza on the release of high mobility group box 1(HMGB1) from endotoxinstimulated macrophages and serum HMGB1 level of endotoxemia mice. Methods： HMGB1 concentration in the culture medium and expression of HMGB1 mRNA were analysed by enzymelinked immunosorbent assay and RTPCR， respectively， after 100 ng/ml lipopolysaccharide(LPS)stimulated macrophagelike RAW 264.7 cells were treated with different doses of Salvia miltiorrhiza extract. In addition， the effect of Salvia miltiorrhiza extract was investigated on serum HMGB1 level and survival rate of endotoxemia mice which were established by intraperitoneal injection of LPS. Results： Salvia miltiorrhiza extract markedly suppressed the release of HMGB1 and expression of HMGB1 mRNA in LPSstimulated macrophages， and decreased serum HMGB1 level of endotoxemia mice with the survival rate elevated. Conclusion： Salvia miltiorrhiza suppressed extracellular release of HMGB1 in endotoxinstimulated macrophages， and conferred protection against endotoxin lethality.

　　［Key words］Salvia miltiorrhiza; high mobility group box 1; macrophages; endotoxemia

　　胞外高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1， HMGB1）为近年发现的一种晚期炎症介质，在脓毒症、关节炎、肺炎、急性胰腺炎等疾病的发病机制中起着十分重要的作用［1-4］。鉴于HMGB1在诸多炎症性疾病病理中的重要性，HMGB1靶向治疗研究已引起广泛重视［3，4］。丹参(Salvia miltiorrhiza)为唇形科鼠尾草属植物的干燥根及根茎，具有活血通经、凉血消肿、祛痈肿丹毒之功效［5，6］。我们在筛选中药抗HMGB1成分研究中发现丹参提取液具有明显抑制巨噬细胞HMGB1释放和保护内毒素血症小鼠的作用，现报告如下。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 实验材料
　　
　　BALB/c小鼠（6～8周，雄性，20～25 g）由江苏省血吸虫病防治研究所提供；丹参购自甘肃天水药材供应站(经无锡市人民医院许英华主任药师鉴定)；巨噬细胞株RAW 264.7购自中国科学院细胞库。内毒素脂多糖（lipopolysaccharide， LPS）为Sigma公司产品，mRNA提取试剂盒为Promega公司产品，MMLV一步法RTPCR试剂盒为上海捷瑞公司产品。
　　
　　1.2 方法

　　1.2.1 丹参提取液的制备

　　丹参经纯水漂洗后，水煎2次，合并2次水煎液，0.2 μm过滤器过滤并调整浓度至1 g/ml(按生药计算)。

　　1.2.2 HMGB1浓度测定

　　采用酶联免疫分析（ELISA）方法。小鼠HMGB1 ELISA试剂盒为武汉中美科技有限公司产品，按产品使用说明书进行。

　　1.2.3 HMGB1 mRNA表达检测

　　应用mRNA提取试剂盒，在细胞培养皿中直接裂解细胞mRNA。HMGB1引物（扩增片段为680 bp）：5′ATGGGCAAAGGAGATCCTA3′（上游），5′ATTCATCATCATCATCTTCT3′（下游）。以三磷酸甘油醛脱氢酶（GADPH）作为内参对照，引物（扩增片段为309 bp）：5′TCCCTCAAGATTGTCAGCAA3′（上游），5′AGATCCACAACGGATACATT3′（下游）。HMGB1 mRNA 表达水平以HMGB1与GADPH基因扩增条带光密度（D）比值表示。

　　1.2.4 培养细胞实验

　　巨噬细胞株RAW 264.7使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在37℃，5% CO2培养箱中进行培养，隔天传代1 次。细胞贴壁覆盖80%～90%时进行实验。以LPS（100 ng/ml培养液)为刺激剂，以不同浓度的丹参提取液（10，30，100 mg/ml)为保护剂，置于巨噬细胞株RAW 264.7培养物中，培养20 h后测定培养上清液中HMGB1水平。实验重复4次。

　　1.2.5 动物实验

　　取BALB/c小鼠50只，以5 mg/kg剂量于小鼠腹腔内注射LPS建立小鼠内毒素血症模型，随机分为内毒素血症（对照）组和丹参处理组各25只，后者于注射LPS后0，24，48，72 h以15 g/kg剂量给小鼠腹腔内注射丹参提取液，观察小鼠存活情况。

　　1.3 统计学方法
　　
　　采用SPSS 11.0统计软件包进行双侧t检验分析和χ2检验分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果

　　2.1 丹参提取液对巨噬细胞HMGB1释放的作用
　　
　　丹参提取液（30，100 mg/ml）明显抑制LPS激活后巨噬细胞株RAW 264.7 HMGB1的释放，并呈剂量相关性，见表1。表1 丹参提取液对巨噬细胞株RAW 264.7培养上清液中HMGB1水平的影响，Tab 1 Effect of Salvia miltiorrhiza extract on HMGB1　level in the culture medium of macrophagelike　RAW 264.7 cells（略）。

　　2.2 丹参提取液对巨噬细胞HMGB1 mRNA表达的影响
　　
　　巨噬细胞株RAW 264.7受LPS（100 ng/ml）激活20 h后HMGB1 mRNA表达显著升高，而丹参提取液（100 mg/ml）对其表达具有明显抑制作用（P&<0.05），见图1。

　　2.3 丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平和存活率的影响
　　
　　丹参提取液对内毒素血症小鼠有明显的保护作用，96 h后小鼠存活率由32%提高至64%（P&<0.05），见图2。同时，丹参提取液明显降低了内毒素血症小鼠血清HMGB1水平（P&<0.05），见表2。表2 丹参提取液对内毒素血症小鼠血清HMGB1水平的影响，Tab 2 Effect of Salvia miltiorrhiza extract on serum HMGB1 level of endotoxemia mice（略）
　　
　　3 讨论
　　
　　高迁移率族蛋白因其在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的高迁移能力而得名，包括HMGA，HMGB，HMGN 3个家族，而HMGB家族有3个成员即HMGB1，HMGB2，HMGB3。HMGB1作为核内一种典型的非组蛋白，长期以来的研究主要集中在其核内功能，包括参与核小体的构建和稳定，调节基因的转录、参与DNA的重组修复和复制等。1999年，Wang等［7］发现HMGB1可通过活化细胞的主动分泌释放到胞外并介导炎症反应，为内毒素血症和脓毒症的重要炎症介质，随后胞外HMGB1的致炎作用引起广泛兴趣和重视。近年来的研究［1-4］证实，胞外HMGB1为一种重要的炎症介质和致炎细胞因子，参与多种疾病如脓毒症、关节炎、急性胰腺炎、肺炎、系统性红斑狼疮、脑膜炎、肾脏疾病、心血管疾病等的发病过程。目前，HMGB1靶向治疗研究已引起人们关注，而HMGB1靶向治疗的关键是研发有效的HMGB1拮抗剂。
　　
　　目前已发现有HMGB1拮抗作用的有抗HMGB1抗体、HMGB1 Abox蛋白和丙酮酸乙酯等［4，7］。中国使用中药历史悠久、资源丰富，中药对许多疾病具有明显的疗效，世界各国对中药的研究和应用也日趋重视，但对中药及其有效成分的抗HMGB1作用研究甚少。本课题组在严重急性呼吸综合征（SARS）暴发期间，曾对国内治疗SARS的几种主要中药配方进行抗HMGB1作用的实验研究，发现这些中药配方具有明显抑制巨噬细胞株RAW 264.7和人外周血单核细胞的HMGB1释放作用，并提出HMGB1参与SARS的发病机制［8］。最近，Chen等［9］和Li等［10］研究发现绿茶提取物和绿茶主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)具有抑制HMGB1释放的作用，后者可明显提高脓毒症小鼠的存活率。
　　
　　丹参是最常用的活血化瘀中药之一，在《神农本草经》中被列为上品，现代药理研究发现丹参具有保护心脏缺血缺氧、改善微循环、抑制血小板聚集和血栓形成、中枢镇静、抗氧化、抗菌消炎及增强免疫功能等作用［5］。本研究显示，丹参提取液对内毒素致巨噬细胞HMGB1释放具有明显的抑制作用，其作用机制与抑制细胞HMGB1基因表达有关，但其信号转导过程值得进一步研究。动物实验结果显示，丹参提取液能明显降低内毒素血症小鼠血清HMGB1水平，同时能提高内毒素血症小鼠的存活率。鉴于胞外HMGB1为内毒素血症致死的重要炎症介质，丹参提取液可能通过抑制细胞HMGB1释放、降低血清HMGB1水平而阻止内毒素血症的发展和恶化。徐鑫荣等［11］报道，丹参注射液能改善内毒素休克兔的心、肝、肺功能，减轻全身炎症反应及部分脏器病理损害，丹参注射液对内毒素休克多器官损伤的保护作用可能与丹参抑制HMGB1释放有关。我们下一步将对丹参抗HMGB1作用的有效成分进行研究。

参考文献

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　　［9］Chen X， Li W， Wang H. More tea for septic patients—Green tea may reduce endotoxininduced release of high mobility group box 1 and other proinflammatory cytokines［J］. Med Hypotheses， 2006，66(3):660-663.

　　［10］Li W， Ashok M， Li J， et al. A major ingredient of green tea rescues mice from lethal sepsis partly by inhibiting HMGB1［J］. PLoS ONE， 2007，2(11):e1153.

　　［11］徐鑫荣，张家留，郑崇明，等.丹参注射液对内毒素休克兔多器官损伤的保护作用［J］.中华急诊医学杂志，2004，13(10):679-681.