切割穹隆海马伞后大鼠海马中83 ku差异蛋白的质谱分析

　　　　作者：朱蕙霞，秦建兵，金国华，田美玲，张新化，黄镇

【摘要】 　　目的： 探讨切割穹隆海马伞海马中具有诱导神经干细胞向神经元分化生物活性的83 ku差异蛋白的组成成分及其功能。 方法： 切割SD大鼠穹隆海马伞后14 d海马进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)，应用电喷雾质谱分析、蛋白质数据库和文献分析等方法对83 ku差异蛋白进行检测和功能分析。 结果： 质谱分析找到了17组肽段，这些蛋白按照其功能可以分为：细胞骨架蛋白、参与代谢的酶、信号传递、蛋白降解、氧化应激、神经递质运输、突触形成、功能未知蛋白。结论： 切割穹隆海马伞海马83 ku差异蛋白可以通过参与Rho信号通路，调控神经干细胞向神经元分化。

【关键词】 83 ku蛋白； 切割穹隆海马伞； 海马； 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳； 质谱分析

　　［Abstract］ Objective: To explore the ingredients and functions of the active 83 ku proteins inducing NSCs to differentiate into neurons from the fimbria/fornix transected hippocampus.Methods： The SpragueDawley rats′ hippocampi on the 14th day after fimbria/fornix transection were used for NativePAGE. Electrospray ionization mass spectrometry，protein data bank and bibliometrics were applied to identify the 83 ku proteins and analyze their functions. Results： Mass spectrometry analysis of 83 ku protein found 17 groups of peptides which were pided into several functional groups：cytoskeletal protein，enzyme in metabolism，signal transduction，protein degradation，oxidative stress，neurotransmitter transport，synapse formation and unknown function protein etc. Conclusion： 83 ku proteins in the fimbria/fornix transected hippocampus may regulate the differentiation of NSCs into neurons via Rho pathway.

　　［Key words］ 83 ku protein； fimbria/fornix transection； hippocampus； Native PAGE； mass spectrometry analysis
　　
　　神经干细胞的发现为中枢神经损伤、退行性疾病以及脑肿瘤等的治疗提供了新思路，但其临床应用还要解决如何诱导神经干细胞迁移及分化等问题。我们近期的研究［1，2］观察到，移植至切割穹隆海马伞侧海马齿状回中迁移的神经干细胞密度明显大于正常侧海马中迁移的密度，在切割侧移植的神经干细胞更易于向神经元分化；在体外细胞培养中，切割穹隆海马伞的海马提取液也比正常海马提取液更能促进神经干细胞向神经元和AChE阳性神经元分化［3］。在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)83 ku蛋白胶条与神经干细胞共培养，证实该差异蛋白能够诱导神经干细胞向神经元分化，在此基础上［4］，本研究进一步应用质谱分析探讨83 ku差异蛋白的组成成分及其功能。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 切割大鼠穹隆海马伞
　　
　　取220～250 g成年SD大鼠10只（南通大学实验动物中心提供），参照Paxinos图谱确定双侧穹隆海马伞的切割范围，按文献［2］方法进行双侧穹隆海马伞切割，然后按性别分笼饲养。
　　
　　1.2 Native PAGE
　　
　　术后14 d取双侧海马组织制成匀浆，进行蛋白定量，然后将蛋白质浓度稀释调整为3 μg／μl后分装，冻存于-70℃冰箱中备用。按文献［5］方法进行NativePAGE电泳，选取部分胶条进行考马斯亮蓝染色、脱色。

　　1.3 电喷雾质谱分析（electrospray ionization mass spectrometry，ESIMS）
　　
　　根据染色、脱色后凝胶显示的83 ku差异蛋白条带位置，切取切割穹隆海马伞后14 d海马组织蛋白胶条［6］，用胰蛋白酶水解20 h后，放入美国Finnigan公司生产的LCQ DECA XP plus质谱仪中进行ESIMS分析，采用微量电喷雾的进样方式，毛细管温度为170℃，柱面积为0.15 mm×0.15 mm(RPC18)，正离子检测。
　　
　　利用Finnigan公司系统中的SEQUEST检索程序，检索IPI HUMAN 数据库（人类蛋白质组，HUPO提供）。检索条件设置为：当电荷为＋１时，Ｘcorr≥1.9；当电荷为＋2时，Ｘcorr≥2.2；当电荷为＋3时，Ｘcorr≥3.75；同时设定匹配肽段间ΔＣｎ≥0.1，蛋　　氨酸可变修饰16.00。
　　
　　1.4 蛋白功能分析
　　
　　质谱分析检索后得到的蛋白质输入PubMed（www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&&DB=PubMed）进行蛋白质功能文献分析。
　　
　　2 结果
　　
　　通过电喷雾质谱分析，在不同的时间点共鉴定到70组蛋白肽段（图1），经过数据库匹配，确定其中17种蛋白成分，搜索蛋白数据库和文献检索结果如表1。表1 切割穹隆海马伞后14 d海马组织83 ku蛋白名称与相关功能，Tab 1 Name and related function of 83 ku proteins in rats′ hippocampus on the 14th day after fimbriafornix transection（略）

　　NDRG2b2Nmyc下游调节基因1的相关蛋白属于分化相关基因NDRG2亚型，涉及神经元的分化，分布集中在生长锥上。受醛固酮诱导，可以激活Ras级联系统，可能在盐皮质激素的信号传导中有重要作用［9］。6Profilin 2（Pfn2）原肌动蛋白抑制蛋白与肌动蛋白结合，影响细胞骨架的结构。在高浓度的时候，阻止肌动蛋白的聚合，而低浓度时加强肌动蛋白的聚合。还可以结合PIP2，阻止IP3和DG的生成［10］。PIIa是脑内特异性的Profilin，在神经分化的初期，RhoA/ROCK/PIIa介导轴突的形成和延伸［11］。　　续表1

　　Tryptophan 5monooxgenase activation protein，zeta，eta polypeptide酪氨酸3/5单加氧酶活化蛋白ζ，η属于1433蛋白家族成员，通过结合含有磷酸化丝氨酸的介导信号传递，调节细胞周期。11peroxiredoxin 2 （Prdx2）过氧化物酶2参与细胞内氧化还原反应，可以从硫氧还蛋白系统接受还原当量，可消除代谢中产生的过量h3O2，在缺氧或脑损伤时通过调节h3O2参与NGF和TNFα的信号传递反应［13］。12Similar to coactosinlike 1肌动蛋白共结合蛋白1以Ca2+非依赖性的方式与丝状肌动蛋白结合，与肌动蛋白解聚无关。13Ubiquitin Carboxylterminal　hydrolase isozyme L1（Uchl1）泛素C末端水解酶的同工酶L1主要表达在脑内神经元中，在海马和嗅球的再生神经元中含量少，在衰老的垂体后叶多，属于巯基蛋白酶，辨认、水解泛素C末端甘氨酸肽键或者结合游离泛素，阻止它在溶酶体中的降解［14］。14Dimethylarginine DimethylaminohyDrolase 1（DDAH1）二甲基精氨酸的二甲基氨基水解酶参与NO的生成。15Rasrelated protein Rab3A（Rab3a）Ras相关蛋白Rab3A是突触囊泡蛋白，作为神经递质在胞吐作用中参与调解突触囊泡融合，在皮质杏仁核LTP和海马CA1CA3突触的LTP末期都是必需的［15］。1645 ku protein45 ku蛋白功能未明。17Rho GDP dissociation inhibitor(GDI) alpha（Gdi1）Rho蛋白的GDP解离抑制因子α抑制Rho蛋白smg p21s(ras p21like small GTPbinding proteins)蛋白的GDP解离、GTP结合。而smg p21s与小脑的发育成正相关，表达在神经末梢［16］。

　　3 讨论
　　
　　本研究采用ESIMS检测切割穹隆海马伞后14 d的大鼠海马83 ku差异蛋白胶条中的多肽，通过质谱分析得到17种蛋白成分，这些蛋白按照其功能可以分为不同种类：细胞骨架蛋白、参与代谢的酶、信号传递、蛋白降解、氧化应激、神经递质运输、突触形成、功能未知。参与信号传导的蛋白种类最多，包括 GDIα，Prdx2，NDRG1 相关蛋白，Pfn2，酪氨酸3/5单加氧酶活化蛋白，Rab3a，Gdi1等，占蛋白肽段的41%，如其中的GDIα，NDRG1 相关蛋白，Rab3a，Gdi1可帮助机体启动损伤的激素应激反应、促进蛋白合成［7］；在中枢神经损伤后可促进突触的形成、突触内囊泡的运输等从而调节神经元分化；酪氨酸3/5单加氧酶活化蛋白、Prdx2参与磷酸化的信号传导过程，与调节损伤后细胞周期、细胞凋亡有密切关系；Pfn2与轴突的生成和延伸相关，参与细胞骨架的生物合成。其次较多的为各种参与代谢反应的蛋白，如参与糖代谢（Glx I）、氧化还原反应（Prdx2）、神经递质合成（DDAH1）、蛋白质代谢（Crym）等的酶。还有细胞骨架蛋白：Actin、微管蛋白α1、肌动蛋白共结合蛋白1，其中Actin、肌动蛋白共结合蛋白1和Pfn2（肌动蛋白结合蛋白）是通过相互作用从而改变肌动蛋白的稳定性，影响轴突的生成及分支。最少的为参与蛋白降解（Uchl1）的蛋白。本次检索中还有1个蛋白（表1中的“16”号）没有查到相应的功能，将有待继续研究。

　　
　　神经元的发育过程中，经历了从分化、迁移、极化、定向生长到与靶细胞建立突触联系的动态过程，也涉及损伤后的修复和再生过程。神经元突起末端的生长锥感受细胞外生长和导向信息，通过微管和微丝运动使细胞形成树突和轴突，并不断生长、延伸或坍塌。这些突触之间的联系在神经元自身和周围细胞活动的作用下得到优化，通过突触的巩固、突触的消除、新突触的形成，最终建立起成熟的神经回路。其中神经元轴突的生成是启动神经干细胞迁移和向神经元分化的第一步，体外海马神经元培养中剔除Pfn2基因实验中，发现RhoA/ROCK/PIIa调节肌动蛋白的稳定性，参与海马神经元分化［11］。
　　
　　RhoA属于Rho家族鸟苷三磷酸酶(Rho GTPases)，是调节细胞骨架运动的主要信号，细胞外生长和导向因子(如Slit)首先通过细胞膜上相应的受体(如Robo)启动Rho激酶，进而通过坍塌反应调节蛋白影响细胞骨架的重排。Rho GTPase能与GTP/GDP结合，以GDP结合和GTP结合两种状态存在，前者为非活化状态，后者为活化状态。Rho GTPase循环的调节有3类分子：嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)、Rho酶活化蛋白(GAPs)和解离抑制因子(Rho GDIs)［17］。上游信号分子和受体通过激活上述3种分子调节Rho GTPase。与Rho GTPase和actin细胞骨架联系的中间蛋白主要有：NWASP，Park，Rock和mDia。Rock是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，为Rho的作用分子，通过RhoA/ROCK/PIIa作用于profilin，调节actin聚合作用［18，19］。
　　
　　在83 ku蛋白中除了Pfn2，还可观察到GDIα，Actin，NDRG1相关蛋白，Tubulin，Similar to coactosinlike 1，Rab3a，Gdi1，7种蛋白都可参与上述Rho信号通路。由本实验结果可推测，切割穹隆海马伞后，这些蛋白通过相互的作用，可以启动神经干细胞向损伤部位迁移、向神经元分化，Rho信号通路参与其中调节神经轴突再生。如何有效地调控Rho信号通路，促进神经干细胞分化为神经元，减少细胞死亡，改善中枢神经系统损伤后功能的恢复，还有待进一步研究。

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