强力霉素抑制丝裂霉素诱导的MTEC1细胞凋亡及其蛋白质组初步分析

　　　　作者：申卫红， 刘慧， 彭鑫， 肖雪媛， 何大澄 陈慰峰， 邵启祥

【摘要】 目的： 探讨强力霉素（doxycycline，Dox）保护胸腺上皮细胞的作用及其机制，为进一步研究Dox的免疫调节作用奠定基础。方法： 利用光学显微镜观察Dox对丝裂霉素(mitomycin， MMC)诱导MTEC1凋亡的影响，同时采用Hochest33342、PI单染、Annexin V和PI双染确认其作用，最后利用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析了SAX2芯片捕获的Dox作用前后的差异蛋白质。结果： 通过形态学观察、Hochest33342、PI单染及Annexin V和PI双染发现Dox确实能保护MTEC1抵抗丝裂霉素诱导的细胞凋亡。随后采用表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术分析SAX2芯片捕获蛋白，发现Dox能调控15种蛋白，其中上调8种，下调7种。结论： Dox具有保护MTEC1，抑制MMC诱导的细胞凋亡作用，并对MTEC1的蛋白表达有调控作用。

【关键词】 强力霉素; 小鼠胸腺髓质上皮细胞系; 细胞凋亡； 蛋白质芯片

　　［Abstract］ Objective: To expose the molecular mechanism of doxycycline(Dox) that protects the mouse thymic epithelial cell line(MTEC1) free from apoptosis which induced by mitomycin(MMC).Methods： The effect of Dox protects the MTEC1 cells antiapoptosis against the MMC induced was observed under an optical microscope， and confirmed by Hochest33342 stain， PI single stain， Annexin V and PI double stain， and observed by fluorescence microscope or flow cytometer. Furthermore， SELDI Protein Chip was used to analyze the profile proteomics of MTEC1 cell which treated by doxycycline or not. Results： Dox was found to protect the MTEC1 free from cell apoptosis not only morphology observed with optical microscope but also detected by Hochest33342 stain， PI single stain， Annexin V and PI double stain. Proteomics assay by surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry(SELDITOFMS) disclosed that the Dox can upregulate 8 proteins expressions and downregulate 7 protein expressions. Conclusion： Dox protects MTEC1 against the apoptosis induced by mitomycin and regulated the proteins expressions in MTEC1. It will contribute to the further exploration of the mechanisms of Dox on MTEC1.

　　［Key words］ doxycycline; mouse thymic epithelial cell line; apoptosis； protein chip　　强力霉素（doxycycline，Dox）是属于半合成的四环素类抗生素，除具有广谱抗菌作用外，还具有抗原虫、螺旋体、衣原体、支原体和立克次体等作用。近年来的研究表明Dox和其他四环素类抗生素还有其他生物学作用，如①抗肿瘤作用：Dox和四环素化学修饰物（chemically modified tetracyclines，CMTs） 通过上调caspase3途径［1］、Fas/FasL途径［2］及p53依赖途径［3］，抑制VEGF［4］、细胞外基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinases2，MMP2），MMP9及VM［5，6］，通过线粒体依赖途径诱导细胞凋亡［1］，从而杀伤多种肿瘤和抑制肿瘤细胞（前列腺癌、血液系统肿瘤、淋巴瘤、乳腺癌及其骨转移瘤和骨肉瘤等）的转移；②抗凋亡作用：Dox和米诺霉素（minocycline，Min）可以通过抑制caspase 3，COX2，p38 MAPK和iNOS的表达，在脑缺血发生时保护脑细胞免于凋亡［7-9］；③抗炎症作用：Dox和CMTs下调单核细胞表面的MHCⅡ抗原表达，抑制软骨细胞、角膜上皮细胞表达炎症介质（IL1，IL6， TNFα和iNOS），抑制IL1转换酶β （IL1 betaconverting enzyme，ICE）的表达；抑制类风湿性关节炎及其软骨和结缔组织的重塑。在血管损伤中能抑制MMP9和VEGF，从而抑制病理性的血管重塑［10］；④促进细胞增殖：Dox可以刺激纤维细胞、正常淋巴细胞增殖，很少引起多发性硬化症患者淋巴细胞增殖和不引起急性播散性脑脊髓炎患者淋巴细胞增殖［11］。⑤免疫调节：Dox下调骨髓来源的树突状细胞（dendritic cells，DCs）其表面标志的共刺激分子CD86，CD80和MHC2Ⅱ；而且在同种异体混合淋巴反应中，Dox抑制DCs刺激同种反应性T细胞增殖能力［12］。我们在使用TetOn表达系统研究胸腺上皮细胞（thymic epithelial cells， TECs)功能调节过程中，意外发现Dox本身对TECs行为有显著影响，其能通过活化ERK通路，促进小鼠TECs细胞系（MTEC1）增殖［13］，也促进原代小鼠TECs的增殖，这一结果提示，Dox可能通过促进TECs增殖的作用，促进T细胞的重建，因此阐明Dox对TECs的作用机制具有重要的意义。本研究采用蛋白质组学的方法初步研究了Dox对MTEC1影响，以期寻找相应的靶分子，为深入研究Dox的生物学作用机制奠定基础。

1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 细胞系 小鼠胸腺髓质上皮细胞MTEC1，由北京大学医学部免疫学系T细胞研究室建立。

　　1.1.2 材料和试剂 FITC标记的Annexin V和PI双染试剂盒：北京宝赛公司产品。Dox，Hochest 33342，PI，已氰，尿素，蛋白酶抑制剂（Leupeptin，Aprotinin和PMSF），Hepes，TriHCl和OGP均购自Sigma公司。注射用丝裂霉素（mitomycin，MMC，日本Kyowa Hakko Kogyo 公司产品）。SAX2蛋白质芯片和阴离子交换柱（Hyper Q DF）购于美国Ciphergen公司。蛋白质芯片阅读机由美国Ciphergen公司生产，PBSIIC型。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 形态学观察Dox对MMC诱导的MTEC1细胞凋亡的作用 MTEC1细胞（3×105/孔） 接种于6孔板中，加入Dox（10 μg/ml）培养36 h，然后加入MMC（10 μg/ml）诱导细胞凋亡，同时设立MMC对照组，培养结束后于倒置显微镜下观察并照相。

　　1.2.2 Hochest33342染色检测细胞凋亡 1×105 MTEC1细胞接种于预先放置无菌小盖片的6孔板，加入Dox 10 μg/ml培养24 h，然后加入MMC继续培养8，18，36，48，60 h，同时设立空白，MMC和Dox对照，Hochest33342染色观察。

　　1.2.3 PI染色 3×105处于对数生长期的MTEC1细胞接种在25 cm2培养瓶中，加入Dox 10 μg/ml培养24 h，然后加入MMC分别继续培养24 h和36 h，同时设立空白，MMC和Dox对照，PI常规染色观察，FACS分析。

　　1.2.4 Annexin V和PI双染 细胞接种同上，加入Dox 10 μg/ml培养24 h，然后加入MMC继续培养24 h，同时设立空白，MMC和Dox对照，Annexin V和PI双染观察。

　　1.2.5 细胞总蛋白的提取 MTEC1培养于10%血清的DMEM培养基中。将处于对数生长期的MTEC1消化，计数，以1×105/孔接种于6孔板中，当细胞长至70%汇合度时换液，并加入10 μg/ml Dox；对照组采用相同体积的PBS处理细胞，并继续培养72 h，当细胞长成单层后，用细胞刷刮取细胞，冷PBS洗3次，加入细胞裂解液（8 mol Urea，4% CHAPS，40 mmol pH7.4的TrisHCl，1 μg/ml的蛋白酶抑制剂Leupeptin，Aprotinin和0.1 mmol PMSF），静置30 min，14 000 r/min离心20 min，取上清。用Bandford法测定总蛋白浓度，分装-80℃备用。

　　1.2.6 水化阴离子交换柱 阴离子交换柱用5倍柱床体积的TrisHCl（50 mol/L，pH9）洗3次，并将上述处理过的柱子储存在0.8 ml 的缓冲液中，4℃过夜，次日使用。

　　1.2.7 上样和洗脱 用1 mol/L尿素调节细胞的蛋白浓度至2 mg/ml。取200 μl滴加到阴离子交换柱的柱床上面，1 100 g/min振荡20 min。

　　1.2.8 蛋白芯片样品的制备 阴离子交换柱采用梯度pH洗脱液（pH9，pH7，pH5，pH4）洗脱，以获得不同pH的流出液组分。每个组分将分别采用SAX2芯片检测。

　　1.2.9 SAX2蛋白芯片检测 将芯片安装于bioprocessor上，芯片AH点加200 μl 结合缓冲液（50 mmol Tris+20 mmol NaCl pH 8.0），振荡室温下孵育5 min，每点分别加25 μl不同组分流出液和75 μl结合缓冲液，振荡孵育60 min，弃掉液体，用200 μl 洗脱缓冲液（50 mmol Tris + 20 mmol NaCl pH 8.0）洗涤芯片2次，每次5 min，加200 μl 1 mmol HEPES（pH7.0）后马上倒去，卸去bioprocessor，取出芯片各点加两次0.5 μl SPA，芯片表面干后，用蛋白质芯片阅读机（PBSIIC型）进行蛋白质谱分析。

　　1.2.10 数据采集和结果分析 蛋白质芯片采用蛋白质芯片阅读机PBSIIC型读取数据。仪器用标准多肽（peptide all in one）和低于200 kDa的蛋白质标准分子（protein all in one） 校正，系统的质量偏差为0.1%。检测芯片时蛋白质芯片阅读机设置如下：激光强度230、检测敏感度8，优化相对分子质量范围3～50 kDa，最高相对分子质量200 kDa，每个样品收集50个点，采用Ciphergen proteinchip 3.0.2版本的分析软件自动采集数据。两个蛋白质峰比较时，标志蛋白定义为蛋白质峰强度相差1倍以上。

　　 2 结 果

　　2.1 Dox抑制MMC诱导的MTEC1细胞凋亡的形态学观察

　　我们在以往的研究中发现Dox能促进MTEC1增殖［13］，而在本次研究中发现Dox不仅能促进MTEC1增殖，而且能保护其抵抗凋亡（图1）。

　　(a)(b)a：Dox （10 μg/ml）实验组，细胞生长致密，存活良好；b：MMC（10 μg/ml）对照组，细胞大部分死亡，仅有少量存活（100×光镜下观察结果，右上角为200×光镜下观察结果）

　　2.2 Hochest33342，PI染色和Annexin V＋PI双染确认Dox的抗凋亡作用

　　Hochest33342染色的形态学观察发现MMC处理MTEC1 36 h能明显诱导细胞凋亡，而Dox也能明显地保护MTEC1细胞免于凋亡，同时发现Dox能明显促进细胞增殖（图2）。PI染色发现在MMC处理36 h后细胞明显凋亡（42.19%），Dox能保护MTEC1抵抗凋亡，使凋亡细胞下降到15.25%（图3）。

　　a～c为Dox处理24 h后MMC诱导MTEC1细胞凋亡24 h；d～f为Dox处理24 h后MMC诱导MTEC1细胞凋亡36 h； a，d：Dox对照组；b，e：MMC处理组；c，f：Dox＋MMC处理组

　　图3 经PI染色后流式细胞术分析Dox抑制MTEC1细胞凋亡作用

　　Fig 3 FCM analyzed the MTEC1 cells that protected by Dox against apoptosis that exposed to MMC with PI staining　　Annexin V＋PI双染观察发现MMC诱导24 h后MTEC1早期凋亡细胞占77.74%，而中晚期凋亡细胞占20.12%；加入Dox使MTEC1早期凋亡细胞下降到51.01%，而中晚期凋亡细胞下降到6.30%（图4）。由此可见，Dox能明显保护MTEC1抵抗凋亡。

　　a：圈门设定；b：正常培养的MTEC1细胞未染色对照；c：正常培养的MTEC1细胞染色对照；d：Dox处理MTEC1细胞24 h；e：MMC诱导MTEC1细胞凋亡24 h；f：Dox处理24 h后MMC诱导MTEC1细胞凋亡24 h

　　2.3 Dox对MTEC1细胞蛋白表达水平的影响

　　为了了解Dox促进细胞增殖和保护MTEC1抵抗凋亡的机制，我们采用蛋白芯片技术对Dox处理前后的MTEC1进行了分析，结果发现Dox作用MTEC1细胞后，SAX2芯片捕获的蛋白中有15种蛋白发生表达变化，其中8种蛋白质表达增高，有7种蛋白质表达降低（表1，图5）。
表1 强力霉素处理后MTEC1细胞蛋白表达

　　横坐标表示相对分子质量，纵坐标表示蛋白质峰的强度。谱图从上至下依次为对照细胞和加药细胞。标记的峰是加药后表达减弱的蛋白，标记蛋白相对分子质量为8 551.2 Da

3 讨 论

　　强力霉素属于半合成四环素类药物，具有广谱的抗菌、抗原虫的生物学活性。近年来发现，其具有广泛的生物学作用，能诱导肿瘤细胞凋亡、抗炎症作用、免疫调节、促进细胞增殖和保护神经细胞抵抗缺血再灌注损伤［1-13］，但是其分子机制尚未完全明确。本项研究发现经Dox处理的小鼠胸腺上皮细胞具有抵抗MMC诱导的细胞凋亡作用。胸腺上皮细胞在T细胞的发育、分化和成熟中具有重要作用。最近的研究发现在HIV或移植物抗宿主排斥反应中，胸腺上皮细胞经常受到严重损伤，其作用方式主要是诱导细胞凋亡；而在对老年小鼠的研究中也发现，老年鼠的骨髓输出的T细胞前体细胞的能力是正常的，关键是胸腺上皮细胞发生了凋亡，因此保护胸腺细胞的药物及其作用对于胸腺功能的重建具有重要意义。蛋白组学是继基因组学兴起的一门新兴学科，通过任何有意义的因素引起的2个样本之间的差异蛋白质谱，可能揭示出细胞生理和病理状态的进程、对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析。其中表面加强激光解析电离飞行时间质谱技术（surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry，SELDITOFMS）是蛋白质鉴定的核心技术，具有快速、操作简便、样品用量少和对多样品的平行检测等特点。已被广泛应用于肿瘤、免疫性疾病和其他疾病标志物的筛选［14-17］。我们在本试验中，采用SELDITOFMS分析了由SAX2芯片捕获的经Dox处理的MTEC1和正常培养的MTEC1细胞的蛋白，结果发现，SAX2芯片捕获的蛋白中有15种蛋白发生表达变化，其中8种蛋白质表达增高，7种蛋白质表达降低。这些被诱导差异表达的蛋白，为开展进一步的分子机制研究提供了有价值的线索。目前我们正通过与WCX2相匹配的亲和柱获得其中感兴趣的蛋白，并进行质谱鉴定，从而为阐明丝裂霉素诱导细胞凋亡以及强力霉素抵抗凋亡的作用途径提供实验依据。

参考文献

［1］ Wu J， Liu T， Xie J， et al. Mitochondria and calpains mediate caspasedependent apoptosis induced by doxycycline in HeLa cells ［J］. Cell Mol Life Sci，2006，63(7/8):949-957.

［2］ Liu J， Kuszynski CA， Baxter BT. Doxycycline induces Fas/Fas ligandmediated apoptosis in Jurkat T lymphocytes ［J］. Biochem Biophys Res Commun，1999，260(2):562-567.

［3］ Wang P， Dorante G， Powell SR， et al. The relationship of HLA antigens to doxycycline induced apoptosis in immortalized B cells ［J］. Front Biosci，2004，9:154-158.

［4］ Kothari M， Simon SR. Chemically modified tetracyclines inhibit VEGF secretion by breast cancer cell lines ［J］. Cytokine，2006，35（3/4）:115-125.

［5］ Sun B， Zhang S， Zhang D， et al. Doxycycline influences microcirculation patterns in B16 melanoma ［J］. Exp Biol Med(Maywood)，2007，232（10）:1300-1307.

［6］ Wong ET， Alsop D， Lee D， et al. Cerebrospinal fluid matrix metalloproteinase9 increases during treatment of recurrent malignant gliomas ［J］. Cerebrospinal Fluid Res，2008，5:1.

［7］ Tang XN， Wang Q， Koike MA， et al. Monitoring the protective effects of minocycline treatment with radiolabeled annexin V in an experimental model of focal cerebral ischemia ［J］. J Nucl Med，2007，48(11):1822-1828.

［8］ Tikka T， Fiebich BL， Goldsteins G， et al. Minocycline， a tetracycline derivative， is neuroprotective against excitotoxicity by inhibiting activation and proliferation of microglia ［J］. J Neurosci，2001，21（8）:2580-2588.

［9］ Mishra MK， Basu A. Minocycline neuroprotects， reduces microglial activation， inhibits caspase 3 induction， and viral replication following Japanese encephalitis ［J］. J Neurochem，2008，105(5):1582-1595.

［10］ Salo T， Soini Y， Oiva J， et al. Chemically modified tetracyclines(CMT3 and CMT8) enable control of the pathologic remodellation of human aortic valve stenosis via MMP9 and VEGF inhibition ［J］. Int J Cardiol，2006，111（3）:358-364.

［11］ Anlar B， Senbil N， Güven A. Doxycycline in autoimmune central nervous system disorders in children: an in vitro study ［J］. Turk J Pediatr，2007，49(3):274-277.

［12］ 张 慧， 史蓓蕾， 俞黎娅， 等. 强力霉素调节大鼠骨髓来源树突状细胞免疫功能的初步研究［J］. 江苏大学学报:医学版，2007，17(2):97-101.

［13］ Chen X， Xia S， Li R， et al. Doxycycline enhances the RasMAPK signaling and proliferation of mouse thymic epithelial cells ［J］. J Cell Biochem，2009，Mar 27.［Epub ahead of print］

［14］ 肖雪媛，卫秀平，何大澄. 应用蛋白质芯片技术从血清中筛选肺癌标志［J］. 中国科学(C辑)，2003，33(3):323-328.

［15］ Wibom C， Mrén L， Aarhus M， et al. Proteomic profiles differ between bone invasive and noninvasive benign meningiomas of fibrous and meningothelial subtype ［J］. J Neurooncol，2009，Apr 7.［Epub ahead of print］

［16］ Calvo FQ， Fillet M， de Seny D.Biomarker discovery in asthmarelated inflammation and remodeling ［J］. Proteomics，2009，Mar 25.［Epub ahead of print］

［17］ Zhang H， Feng J， Chang XH，et al. Effect of surfaceenhanced laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry on identifing biomarkers of endometriosis ［J］. Chin Med J(Engl)， 2009，122(4):373-376.