鼠肺成纤维细胞在细胞外基质支架中的生长特性

　　　　　　作者：丁浩 严玉兰 刘洋 步雪峰

【摘要】 目的： 研究鼠肺成纤维细胞(lung fibroblast，LF)在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）支架中的生长特性。方法： 将纤维蛋白原、层黏连蛋白和纤黏连蛋白按一定比例混合后，在新鲜大鼠血浆促凝作用下，构建单层毯状细胞外基质支架，并同时加入转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)。将原代培养并纯化传代的鼠LF植入支架，应用倒置显微镜、免疫荧光和免疫印迹方法观察鼠LF在三维培养中的生长特性。结果： 鼠LF在ECM支架及加入TGFβ的支架中的细胞增殖、转化及Ⅰ型胶原合成能力均明显强于普通单层培养。结论： 鼠LF在ECM支架中有良好的生长特性，为体外研究LF在肺间质纤维化中的作用提供了一种新的方法。

【关键词】 肺成纤维细胞； 细胞外基质； 三维培养

　　［Abstract］ Objective: To investigate the biological characteristics of lung fibroblasts from rats which were seeded on ECMscaffold.Methods： Under the role of promoting coagulation of fresh rat plasma， three materials including fibrinogen，laminin and fibronectin each at a certain concentration were constructed to the monolayer ECMscaffold， on the surface of which purified lung fibroblasts were planted； and the TGFβ were added in the ECMscaffold respectively.The biologic characteristics of lung fibroblasts were observed and analyzed by means of inverted microscope， immunofluorescence chemistry and Western blot. Results： The biological characteristics of lung fibroblasts in both ECMscaffold and ECMscaffold with TGFβ demonstrated more active and higher expressing in cell proliferation， differentiation and collagen synthesis than that in the monolayer culture. Conclusion： The lung fibroblasts seeded on ECMscaffold could grow and proliferate well.This model could be used for the study of interstitial lung disease.

　　［Key words］ lung fibroblasts； extracellular matrix； threedimensional culture

　　特发性肺间质纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一种病因不明、发病机制不清、缺乏治疗手段的致命性弥漫性肺间质疾病。随着对IPF本质认识的深入，肺成纤维细胞(lung fibroblast，LF)已成为IPF治疗研究的靶细胞， LF的增殖及其向肌成纤维细胞（myofibroblast，MF）的转型是影响IPF发生发展的关键。成纤维细胞的体外培养主要分单层培养和立体培养两种。目前广泛应用的是单层培养，该方法并不适于研究细胞在体内条件下的生物学行为，而三维培养的细胞更能模拟细胞在体内的生理状态。近年来随着组织工程学的兴起，人工细胞外基质(extracellular matrix，ECM)可为细胞的停泊、生长、繁殖、新陈代谢、新组织的形成等提供支持并在体外得以实现。目前国内外学者已相继建立了一系列不同的成纤维细胞三维培养方法，如刘志国等［1］采用胶原凝胶系统三维培养了人皮肤成纤维细胞，但主要着重于创面修复。研究肺成纤维细胞在三维培养中特性的文献尚不多。

　　本研究旨在运用组织工程学的方法对比LF在普通单层培养、人工合成ECM支架和加入转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGFβ)的支架中不同的生长特性，以寻找一种更适合模拟体内环境的培养方法，从而更好地在体外研究LF在肺间质纤维化中的作用。

1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　新生1天 SD 红皮鼠购于江苏大学动物实验中心；胎牛血清，细胞培养基DMEM(低糖型)和F12，胰蛋白酶购于 Gibco公司；培养瓶、6孔、24孔培养板及圆玻片购于NUCLON公司；纤维蛋白原（fibrinogen，FG；F6755）、纤黏连蛋白（fibronectin，FN；F7049）和层黏连蛋白（laminin，LN；L2020）购于Sigma公司； hTGFβ1购于PeproTech公司；兔抗波形蛋白（vimentin）、α平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，αSMA）、Ⅰ型胶原多克隆抗体购于博士德公司；新鲜鼠血浆为未加抗凝剂大鼠全血高速离心（4 000 r/min，5 min）后的上清，自制。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 鼠肺成纤维细胞的原代培养、传代及鉴定 参照文献［2］的方法。将新生1天的SD红皮鼠肺组织修剪、消化、离心、接种，每3天换液1次。如细胞纯度不够，可采用差时贴壁法。经相差显微镜及vimentin免疫荧光鉴定，取生长状态良好的第3代细胞实验，按1×106/ml密度接种。

　　1.2.2 细胞外基质支架的制备 将FN和LN溶解于无血清DMEM/F12（v/v=1∶1，pH=7.2）混合培养基后，FG溶于FN/LN混合液中，加入等体积新鲜鼠血浆可使上述FG/FN/LN胶状混合物于30 min内定形，FG，FN和LN在支架内的终浓度分别为50 mg/ml，5 μg/ml和5 μg/ml。24孔培养板中即为每孔10 μl的胶状混合物和等体积的新鲜鼠血浆（总体积20 μl），于无菌圆盖玻片上制备成一直径12.0 mm、厚度2 mm透明的毯状支架。6孔培养板中为每孔加入100 μl的胶状混合物和等体积的新鲜鼠血浆（总体积200 μl）。

　　1.2.3 实验分组 实验分为3组：①对照组（普通单层培养），②支架组（细胞外基质支架三维培养），③TGFβ组（细胞外基质支架中加入hTGFβ1三维培养）。其中TGFβ组为制备FG/FN/LN胶状混合物时加入hTGFβ1使其支架内终浓度为10 ng/ml。

　　1.2.4 倒置显微镜观察 取24孔培养板中各组生长状态良好的第14天细胞分别照相。

　　1.2.5 免疫荧光观察 取24孔培养板中各组生长状态良好的第14天细胞，弃培养液，加4 %低聚甲醛固定至少6 h，TBS洗涤3遍，每次5 min，每孔内加0.4 %triton X100+3 %牛血清白蛋白400 μl，0.5～1 h（保持37℃），在相应培养孔内按1∶200分别加入vimentin一抗300 μl，4℃孵育24 h， TBS洗涤3遍，然后按1∶300分别加抗兔-CY3二抗300 μl，室温下孵育45 min，荧光显微镜观察染色满意，用TBS洗涤3遍。按1∶10 000加核荧光抗体进行核标记，然后照相。

　　1.2.6 蛋白质印迹法检测相关蛋白 ①蛋白提取:取6孔培养板中各组生长状态良好的第14天细胞，弃培养液，加入PBS液1 ml后刮细胞入EP管，离心，加入CERA，Vortex， CERB等进行蛋白提取。②蛋白样品分离: 8 % SDSPAGE，每泳道上样蛋白量为20 μg，以80 V/30 min积层， 120 V/100 min分离蛋白样品。③电转膜: 4°C， 90 mA恒流转膜过夜。结束后，取出PVDF膜置3 %BSA室温封闭1 h。④蛋白免疫印迹:将膜分别以兔抗Vimentin，αSMA，Ⅰ型胶原多克隆抗体(1∶100)，RT孵育2 h， 用TBS/T(含有0.1% Tween220 的TBS)漂洗3次，加入HRP标记的血清抗兔IgG(1∶10 000稀释)， RT孵育1 h，以TBS/T漂洗3次后，用ECL发光试剂显示阳性条带，条带用GenSnap/GeneTool软件分析。

　　1.3 统计学方法

　　数据采用SPSS13.0统计软件分析处理，结果以均数±标准差(±s)表示，统计学处理采用方差分析，以P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 倒置显微镜下细胞形态

　　14天时对照组细胞呈长梭形、条索状，但增殖较慢；支架组细胞彼此连接成网状，无法观察其中的细胞形态，分界较为模糊；TGFβ组细胞几乎长满整个6孔板底，细胞几乎全部融合，似栅栏状，呈复层生长（图1）。　　

　　2.2 免疫荧光结果

　　肺成纤维细胞vimentin 染色阳性，胞质内围绕细胞核呈红色丝状网络形态，犹如树叶的叶脉，Hoechst 33342标记细胞核为蓝色。14天时对照组细胞充分伸展，融合成片；支架组细胞呈漩涡状密集生长，分界较为模糊；TGFβ组细胞分界更为模糊，呈复层生长（图2）。

　　2.3 蛋白质印迹结果

　　第14天时，支架组αSMA，vimentin，Ⅰ型胶原蛋白水平比对照组显著升高(P均&<0.05)； TGFβ组αSMA，vimentin，Ⅰ型胶原蛋白水平与支架组相比亦显著升高(P均&<0.05)（图3，表1）。表1 14天时各组αSMA，vimentin，Ⅰ型胶原蛋白表达水平的比较

3 讨 论

　　肺间质纤维化的病理特征是肺泡上皮的损伤、成纤维细胞增殖及大量细胞外基质的沉积［3］，形成的关键步骤和核心环节是成纤维细胞的活化［4］，活化的成纤维细胞可发生功能和表型改变，转变为肌成纤维细胞，具有表达αSMA的能力，是合成Ⅰ，Ⅲ型胶原为主的细胞外基质的主要效应细胞。TGFβ可通过刺激未成熟成纤维细胞生长、聚集及活化，促进细胞外基质的表达，抑制细胞外基质的降解，起到明确的促纤维化作用［5，6］。

　　目前广泛应用并发展较为完善的成纤维细胞培养方法是单层培养。细胞的形态和功能与其所依附的环境密切相关， 在机体组织中， 细胞被细胞外基质包围， 它们与细胞之间有着密切的联系，因此普通单层培养方法并不适合研究细胞在体内条件下的生物学功能［7］。我们采用细胞外基质中的FG，FN和LN等3种组分，混合新鲜鼠血浆促凝形成凝胶状支架。该3种组分与肺成纤维细胞具有良好的组织相容性，形成的三维立体多孔结构支架能提供较大的表面积和适宜的空间，既有利于细胞黏附、增殖和分化，又有利于细胞自身合成和分泌的细胞外基质沉积、营养和氧气进入、代谢产物排出，从而使细胞得以更好地代谢［8］。

　　本实验将原代培养并纯化鉴定的鼠肺成纤维细胞种入细胞外基质支架中，加入TGFβ调控因子，观测到14天时肺成纤维细胞vimentin阳性表达及vimentin，αSMA，Ⅰ型胶原蛋白表达在对照组、支架组、TGFβ组依次增强，提示细胞外基质支架较普通平面培养促进了肺成纤维细胞增殖、转化和胶原合成，而在支架中加入TGFβ更促进了这种增殖、转化和合成。

　　以上结果说明鼠肺成纤维细胞在细胞外基质支架中的生长特性优于普通平面培养，再加上TGFβ等细胞因子的调控，某种程度上能模拟体内成纤维细胞灶中成纤维细胞的生长方式，为体外研究肺纤维化提供了一种新的方法。

参考文献

［1］ 刘志国，郇京宁，陈玉林，等.三维培养的人皮肤成纤维细胞的实验研究［J］.中华整形外科杂志， 2004， 20(6): 444-447.

［2］ 严玉兰，刘 洋，步雪峰，等.鼠肺细胞的分离纯化及原代培养［J］.江苏大学学报：医学版， 2008， 18(1): 11-14.

［3］ Katzenstein AL， Mayers JL.Idiopathic pulmonary fibrosis:clinical relevance of pathologic classification［J］.Am J Respir Crit Care Med， 1998， 157(4 Pt1): 1301-1315.

［4］ Ramos C， Montao M， GarcíaAlvarez J， et al.Fibroblasts from idiopathic fibrosis and normal lungs differ in growth rate， apopsis， and tissue inhibitor of metalloproteinases expression［J］.Am J Respir Cell Mol Biol， 2001， 24(5):591-598.

［5］ Greenberg RS， Bernstein AM， Benezra M， et al.FAKdependent regulation of myofibroblast differentiation［J］.FASEB J，2006，20(7):1006-1008.

［6］ Gewaltig J.Mangassersteplan K， Gartung C， et al.Association of polymorphisms of the transforming growth factorbeta 1 gene with the rate of progression of HCVinduced liver fibrosis［J］.Clin Chim Acta， 2002， 316(1/2):83-94.

［7］ Colige AC， Lambert CA， Nusgens BV， et al.Effect of cellcell and cellmatrix interactions on the response of fibroblasts to epidermal growth factor in vitro［J］.Biochem J， 1992， 285(Pt1): 215-221.

［8］ Winters BS， Raj BK， Robinson EE，et al.Threedimensional culture regulates Raf1 expression to modulate fibronectin matrix assembly［J］.Mol Biol Cell，2006，17(8):3386-3396.