5AzaCdR对人肾癌OSRC2细胞生长及γ连环蛋白表达的影响

　　　　 作者：陶美满， 孙浩， 田福起， 马克钧， 郭涛， 潘鹏， 徐强

【摘要】 目的： 研究甲基化抑制剂5氮杂2′脱氧胞苷（5AzaCdR）对人肾癌OSRC2细胞增殖、凋亡及γ连环蛋白（γcatenin）表达的影响。方法： 使用不同浓度（10-7，10-6，10-5，10-4 mol/L）的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5AzaCdR处理OSRC2肾癌细胞株。MTT检测5AzaCdR对肾癌细胞株OSRC2的生长抑制作用。流式细胞仪检测5AzaCdR对OSRC2肾癌细胞株凋亡的影响。细胞免疫化学检测5AzaCdR处理OSRC2肾癌细胞株后γcatenin表达的变化。结果： 5AzaCdR明显抑制肾癌细胞的增殖，促进其凋亡，且与药物浓度及作用时间有关。药物处理后γ连环蛋白表达增加。结论： γcatenin蛋白表达受甲基化的抑制，提示5AzaCdR可使γcatenin基因去甲基化而抑制肾癌OSRC2细胞株增殖，并促进其凋亡。

【关键词】 5氮杂2′脱氧胞苷； 肾癌； γ连环蛋白； 细胞凋亡; 甲基化

　　［Abstract］ Objective: To investigate the effect of methylation inhibitor 5Aza2deoxycytidine on the growth of human renal cancer cell line OSRC2 and γcatenin expression.Methods： Human renal carcinoma OSRC2 cells were treated with different concentrations of 5AzaCdR（10-7，10-6，10-5，10-4 mol/L） respectively.Then the growth rate of the cells was detected by MTT assay.The apoptosis was analyzed by flow cytometry.The immuneocytochemistry was used to detect γcatenin levels in the cell line before and after treatment with 5AzaCdR. Results： 5AzaCdR can inhibit the growth of OSRC2 cells，and the apoptotic rate was also increased after 5AzaCdR treatment.γcatenin expression levels in OSRC2 cells were increased after 5AzaCdR treatment. Conclusion： γcatenin expression levels were inhibited by methylation， 5AzaCdR can inhibit the growth，and promote the apoptosis of OSRC2 cells by inducing demethylation in the promoter region of γcatenin gene.

　　［Key words］ 5Aza2deoxycytidine; renal carcinoma; γcatenin; cell apoptosis;methylation

　　肾细胞癌的发病率居泌尿系统肿瘤的第二位，目前的治疗仍以根治性手术为主，但术后复发率达20%以上，且放、化疗效果不佳，因此迫切需要早期诊断方法和其他有效的治疗［1］。肾细胞癌的发生、发展与多种因素有关， 抑癌基因失活是关键因素之一。研究表明， 抑癌基因失活的主要方式有基因的缺失、突变和启动子区域的过甲基化等［2］。γ连环蛋白(γcatenin)是一种多功能蛋白质，近年研究显示γcatenin蛋白在多种肿瘤中表达减少， 国外有研究证实在肾癌组织及细胞其表达明显下调［3］，启动子区域CpG岛的过甲基化可能是其失活的主要方式，国内尚无相关的研究。我们采用5氮杂2′脱氧胞苷(5AzaCdR)对肾癌细胞株进行处理，检测γcatenin表达，进一步研究肾癌细胞中γcatenin表达下降是否与基因甲基化有关，探索上调或恢复肾癌细胞中γcatenin正常表达的可能机制。

1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　人肾癌细胞株OSRC2购于上海细胞生物所；胎牛血清（杭州四季青）；DMEM培养基、胰酶、DAB显色试剂盒及SABC试剂盒（武汉博士德）；5AzaCdR（Sigma 公司），用PBS充分溶解后保存于70℃冰箱备用；兔抗人γ连环蛋白多克隆抗体、MTT及二甲亚砜（Sigma 公司）；凋亡检测试剂盒(美国BD公司)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞培养 人肾癌细胞株OSRC2用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养（37℃，5％CO2，饱和湿度），隔日换液，细胞长满培养瓶壁的80％～90％后，按照1∶3传代，取对数生长期的细胞进行试验。

　　1.2.2 MTT法检测细胞增殖活性 对数生长期细胞以每孔5 000个细胞密度接种于5块96孔板中，过夜贴壁后，加入不同浓度的5AzaCdR，每孔180 μl，每组设5个复孔，并设不加药的对照孔和不接种细胞的调零孔。药物和培养液每24 h更换1次，每天取出1板，加入5 g/L的MTT溶液20 μl，37℃，5％CO2培养箱中继续培养4 h后弃去上清，每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min充分溶解结晶，置酶联免疫检测仪上测定波长490 nm下的光密度值，细胞生存率以平均光密度（D）值分析，以D值为纵坐标，以时间（h）为横坐标，绘制生长曲线图。

　　1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡 按照试剂盒的说明操作，收集药物处理后的细胞，用PBS洗涤2次，缓冲液调整细胞浓度为106/ml，取100 μl加入5 ml流式管，然后加入5 μl AnnexinVFITC混匀后，加入5 μl PI混匀。避光、室温孵育15 min，加入400 μl缓冲液，以流式细胞仪进行检测，以未用药物处理的细胞作对照。

　　1.2.4 细胞免疫化学法检测γcatenin表达 采用细胞爬片法，按试剂盒说明采用ABC三步法。参照文献［4］方法进行半定量评分（分A，B两项）：A项，按切片中细胞显色深浅计分，0分：细胞无显色，1分：显浅黄色，2分：显黄色，3分：显棕黄色；B项，按显色细胞的比例评分，1分：1％～30％，2分：31％～75％，3分：76％～100％。两项指标结合积分：阴性（）积分为0分；阳性（+）积分为1～4分；强阳性（++）积分为5～6分。每组计数5个视野，每个视野计数200个细胞。

　　1.2.5 统计学处理 采用SPSS11.5软件包进行统计学分析，多组比较采用F分析，两两比较采用LSDt检验，非正态数据组间两两比较采用Nemenyi法检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 不同浓度5AzaCdR处理后OSRC2细胞的增殖活性

　　MTT检测发现5AzaCdR能抑制人肾癌细胞株OSRC2增殖(图1)，且与时间和药物浓度有关。

　　2.2 不同浓度5AzaCdR处理后OSRC2细胞的凋亡结果

　　不同浓度(10-7，10-6，10-5 mol/L)的5AzaCdR处理OSRC2细胞后，其各组细胞凋亡率分别为（3.74±0.34）%，（7.85±0.59）%，（12.93±1.32）%，对照组为（0.86±0.08）%，采用F检验，F=189.7，P&<0.01，进一步采用LSDt检验，10-7，10-6，10-5 mol/L，0 mol/L之间两两比较，P均＜0.05，差异有统计学意义。（10-4 mol/L的5AzaCdR处理72 h后细胞大多死亡，无法检测。）

　　2.3 细胞免疫组化结果

　　采用KruskalWallis H检验，H=228.92，P&<0.01；进一步采用Nemenyi法两两比较，10-7 mol/L和10-6 mol/L 5AzaCdR两组间χ2 =252.16，10-7 mol/L和10-5mol/L 5AzaCdR两组间χ2 =396.48，10-6 mol/L和10-5 mol/L 5AzaCdR两组间χ2 =12.87，P均＜0.01。表明经甲基化抑制剂处理后γcatenin表达增加，各组间差异均有统计学意义（图2，表1）。 表1 不同浓度免疫组化积分结果（细胞数n＝200）

　　3 讨 论

　　γcatenin是一种多功能蛋白质，相对分子质量约为83 kD，基因定位于17q21上，参与由Ecadherin介导的细胞间黏附与信号传导两大功能，研究显示γcatenin在非小细胞癌［5］、乳腺癌［6］等多种肿瘤中表达减少，与肿瘤的发生、发展密切相关，但其在肿瘤中表达下降的机制尚不清楚。DNA甲基化在肿瘤相关基因表达中具有重要作用，它可以通过基因启动子及其附近区域内CpG岛胞嘧啶的甲基化关闭某种组织或细胞不必要的基因，使之不表达或沉默。研究表明，抑癌基因的失活和表达降低与其启动子区域的高甲基化状态有关［7，8］，而DNA甲基转移酶的表达水平升高和活性增加被认为是引起抑癌基因启动子区域发生高甲基化的主要原因之一［9］。 5AzaCdR是DNA甲基转移酶1(DNMT1)的抑制剂，体外实验证明其可抑制多种肿瘤细胞的生长。肾癌中γcatenin表达减少可能与其基因甲基化有关［3］，国内尚无相关报道。

　　本实验用5AzaCdR处理人肾癌OSRC2细胞后，从MTT法检测的细胞生长曲线可以看出细胞增殖受到不同程度的抑制，流式细胞仪检测发现5AzaCdR 能促进OSRC2的凋亡，这提示5AzaCdR抑制肾癌细胞生长是通过诱导其早期凋亡来实现的。免疫组化显示OSRC2细胞经5AzaCdR处理后γcatenin蛋白表达增加，且与5AzaCdR浓度有关，细胞生长缓慢，恶性程度下降，说明γcatenin蛋白具有抑制肾癌细胞生长的作用。同时γcatenin蛋白表达受甲基化的抑制，5AzaCdR可使γcatenin基因去甲基化上调γcatenin蛋白表达，这说明肾细胞癌中γcatenin基因可能存在过度甲基化，而其过甲基化就是引起γcatenin蛋白在肾癌细胞株中表达下降甚至缺失的主要机制，这需要我们更深入的研究。目前，5AzaCdR在国外已有用于治疗白血病的尝试［10］。

　　综上所述，γcatenin蛋白在肾癌细胞株中表达明显下降，5AzaCdR能上调其表达，诱导肿瘤细胞凋亡。进一步对γcatenin基因甲基化的研究为探讨肾细胞癌的发病机制和早期诊断、治疗提供了一种新思路。

参考文献

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