PTDmFoxp3抑制小鼠皮肤移植排斥反应的研究

　　 作者：舒新军， 季宝菊， 蔺昕， 许逊， 田雨香 俆三荣， 邵启祥

【摘要】 目的： 研究带有蛋白穿膜结构域的小鼠Foxp3融合蛋白（mouse Foxp3 fusin protein combining with transduction domain， PTDmFoxp3）对小鼠脾淋巴细胞活化增殖能力和皮肤移植排斥反应的影响。方法： 取健康C57BL/6小鼠脾淋巴细胞，在体外经刀豆蛋白A(concanavaline A， ConA)活化，并分别给予环孢素A（cyclosporine，CsA）、不同浓度的PTDmFoxp3，mFoxp3，PTDGFP和培养基处理，检测脾淋巴细胞增殖指数。在此基础上进行从Balb/c小鼠到C57BL/6小鼠的皮肤移植试验，将40只C57BL/6受体小鼠随机分为4组，每组10只，分别以PTDmFoxp3，CsA，0.9%氯化钠注射液（NS），PTDGFP于手术当天开始连续腹腔注射8天为干预手段。术后第9天各组随机取2只移植小鼠，采集皮片标本，进行组织学检查。其余的8只用于观察移植皮瓣的存活时间。结果： PTDmFoxp3和CsA相似，与其他处理方法相比明显抑制ConA活化的小鼠脾淋巴细胞增殖指数（P&<0.05）。PTDmFoxp3组，CsA组移植物的存活时间较各对照组显著延长（P&<0.05）；病理检查显示PTDmFoxp3组和CsA组移植物淋巴细胞浸润明显轻于各对照组。结论： PTDmFoxp3能抑制ConA活化的T淋巴细胞的增殖，且具有抑制小鼠皮肤移植排斥反应的作用。

【关键词】 小鼠Foxp3融合蛋白； 免疫抑制； 移植排斥

　　［Abstract］ Objective: To investigate the potential inhibiting ability to active lymphocytes proliferation and skin allograft rejection of the fusion protein of mouse forkhead box P3 combining with protein transduction domain(PTDmFoxp3) in mice.Methods： The singlecell suspension of lymphocytes was prepared from mouse spleen. Polyclonal activator Con A was added to active the lymphocytes. Then the singlecell suspension of lymphocytes was incubated with different concentrations of PTDmFoxp3，PTDGFP，cyclosporine， and blank control for 48h， respectively. The bioactivity of inhibiting lymphocytes proliferation of each group was detected by incorporating of CCK8 in vitro. Allogeneic fullthickness grafts from Balb/c mice were transplanted onto the back of C57BL/6 mice. Forty C57BL/6 mice were randomly pided into four groups， with each group having 10 mice and receiving a different treatment including PTDmFoxp3， cyclosporine， 0.9% physiological saline injection and PTDGFP， respectively. On the same day of the skin transplantation， the treating regents were injected into C57BL/6 mice abdomen and did continuous injection for another 7 days. Two mice of each group were selected out randomly for histological observation till 9th day after skin transplantation. The survival time of other mice were observed. Results： The bioactivity of PTDmFoxp3 was similar to cyclosporine， they could inhibit cells proliferation of mouse activated lymphocytes efficiently in vitro(P&<0.05， comparing with blank control and PTDGFP control)， they could prolong the mean survival time(MST) of skin allograft significantly(P&<0.05， comparing with blank control and PTDGFP control). The infiltration of the lymphocytes in the allografts of PTDmFoxp3 treated groups and cyclosporine were reduced. Conclusion： The PTDmFoxp3 can inhibit activated mouse lymphocytes proliferation in vitro and skin allograft rejection in vivo.

　　［Key words］ PTDmFoxp3； immunosuppression； transplant rejection

　　诱导器官特异性的免疫耐受是解决器官移植排斥反应的最佳方式。近年来的研究表明CD4+CD25hi调节性T细胞（regulatory T cells，Treg）在维持自身免疫耐受和诱导针对外源性抗原的耐受中具有重要功能［1］。尽管最近有多个实验室关于Treg诱导方法的报道，但要获得足量的Treg用于临床治疗仍然十分困难。Foxp3在CD4+CD25hi Treg的发生、发育、分化和生物学功能发挥中起着关键作用。转染了Foxp3基因的CD4+CD25-T细胞在体内、体外均表现了与天然CD4+CD25hi Treg十分相似的表型和生物学功能［2］。CD4+CD25hiT细胞中Foxp3表达下调，Treg仍能维持其免疫无能性，但其免疫抑制性功能丧失，还使得CD4+T细胞更易于向Th3细胞极化，从而诱发自身免疫性疾病［3］。因此，维持Foxp3蛋白在CD4+T淋巴细胞内高水平表达是获取Treg的一个重要途径。尽管转染Foxp3基因方法十分直接，但存在操作复杂、基因的表达不稳定和表达调控困难等问题，而且在临床应用中存在生物安全隐患。本研究拟观察带有蛋白穿膜结构域的小鼠Foxp3融合蛋白（ mouse Foxp3 fusin protein combining with transduction domain， PTDmFoxp3）在体外对ConA活化的小鼠淋巴细胞增殖的影响，及体内应用PTDmFoxp3对实验性同种异基因小鼠皮肤移植排斥反应的影响，探讨PTDmFoxp3的功能，为其应用于免疫相关性疾病的治疗奠定实验基础。

1 材料与方法

　　1.1 试剂和药物

　　环孢素A(CsA，Novartis 公司产品)；刀豆蛋白A(ConA，SigmaAldrich 公司产品)；cell counting kit8(CCK8，Dojindo Laboratories 公司产品)； RPMI1640和小牛血清（Invitrogen 公司产品）；PTDmFoxp3，PTDGFP，mFoxp3等重组融合蛋白由本实验室构建、表达、纯化［4］。

　　1.2 实验动物

　　清洁级6周龄Balb/c小鼠和C57BL/6小鼠购自扬州大学比较医学中心，雄性，体质量18～20 g。动物生产许可证：SCXK（苏）2002-0009，动物使用许可证：SCXK（苏）2002-0045。均饲养于江苏大学基础医学与医学技术学院动物中心SPF级屏障环境内，饲料经辐照消毒，垫料和饮用水均高压消毒灭菌。

　　1.3 脾淋巴增殖反应试验

　　C57BL/6小鼠麻醉处死后，无菌取脾，置于盛有10%小牛血清（NCS）的RPMI1640培养液的无菌培养皿中，于200目尼龙网上轻研，将脾细胞分散成单细胞悬液。将细胞悬液移至离心管中，加入5 ml含10%NCS的RPMI1640培养液，于4℃ 1 500 r/min离心10 min。去上清，加入0.84%NH4Cl 2 ml，37 ℃孵育1 min裂解红细胞，再用2%NCS的PBS洗涤2次，加入5 ml含10%NCS的RPMI1640培养液重悬小鼠脾淋巴细胞。于96孔板中每孔加入C57BL/6小鼠脾淋巴细胞5×105，每孔加入ConA（终浓度15 μg/ml），处理组分别加入CsA（终浓度1 μg/ml），PTDmFoxp3（终浓度320， 640，1 280 nmol/L），PTDGFP（终浓度640 nmol/L），mFoxp3（终浓度640 nmol/L），每组均做3个复孔。用10%NCS的RPMI1640培养液补足液体，使每孔终体积为200 μl。将细胞置于37 ℃，5% CO2培养箱中培养48 h后，按试剂盒操作说明每孔加入20 μl的CCK8试剂。在孵箱中继续培养3 h后，用酶联免疫分析仪，在450 nm处测定各孔光密度(D)值，并计算刺激指数（stimulation index，SI=实验孔D值/对照孔D值）。

　　1.4 同种异基因小鼠皮肤移植试验

　　以C57BL/6小鼠为受体，Balb/c小鼠为供体，进行背部皮肤移植。取Balb/c小鼠背部全厚皮片（圆形皮片直径约1 cm），刮去皮下脂肪组织，移植于去除背部皮片的C57BL/6小鼠背部，用创可贴包扎伤口，单笼饲养。于皮肤移植后第3天开始，每日观察移植皮片的颜色、硬度、有无结痂脱落及鼠毛生长情况。如果皮片颜色变灰暗、变硬，则判为移植皮片排斥开始；结痂脱落，则判为移植皮片排斥终点。

　　1.5 皮肤移植物生存期及组织病理学检查

　　将移植过皮片的C57BL/6小鼠40只随机分为4组，每组10只，分别给予PTDmFoxp3 85 nmol/(kg·d)，CsA 20 mg/(kg·d)，NS 40 ml/(kg·d)，PTDGFP 85 nmol/(kg·d)。PTDmFoxp3和CsA剂量

参考文献

［5］并通过预试验确定，在上述药物剂量下能够较明显地抑制移植皮片的排斥反应。无关蛋白对照组和生理盐水对照组剂量参照实验组蛋白剂量和体积确定。各组均为手术当天开始腹腔注射给药，连续注射8天。于皮肤移植后第9天随机取2只处死，用于组织病理学检查，剩余8只用于小鼠皮肤移植物生存期观察。

　　1.6 统计学处理

　　所得数据以均数±标准差(±s)表示，组间差异用单因素方差分析(ANOVA);两两比较用SNKq检验；P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 淋巴细胞增殖试验结果

　　经ConA活化后各组小鼠脾细胞均有增殖，但PTDmFoxp3组及CsA组脾细胞对ConA活化的增殖强度均低于对照组、PTDGFP组及mFoxp3组，差异具有统计学意义(P&<0.05)。随着PTDmFoxp3浓度增加，PTDmFoxp3对ConA活化的脾细胞增殖抑制强度逐渐增强，而PTDmFoxp3各浓度组与CsA组相比无明显差异。见表1和图1。表1 混合淋巴细胞增殖试验结果

　　2.2 移植皮片存活状况

　　4组移植物的存活时间分别为: PTDmFoxp3组(13.6±1.50)d，CsA组(14.2±1.28)d，NS组(10.0±1.07)d，PTDGFP组(10.5±1.31)d。与NS组及PTDGFP组相比，PTDmFoxp3组及CsA组移植皮片存活时间显著延长，差异有统计学意义（P&<0.05）；但PTDmFoxp3组与CsA组相比，移植皮片存活时间无明显差异，NS组及PTDGFP组相比差别亦无统计学意义。

　　2.3 移植皮片病理学改变

　　皮片移植术后第9天取皮片组织，进行组织切片，HE染色，显微镜下观察发现：PTDmFoxp3组及CsA组，移植皮片中有少量淋巴细胞浸润，毛囊及皮下脂肪组织结构完整（图2A，B）；NS组及PTDGFP组可见皮片中有弥漫淋巴细胞浸润，皮下组织结构不清（图2C，D）。

　　3 讨 论

　　CD4+CD25hiTreg是一类具有免疫调节功能的T细胞，在维持机体免疫自稳和调节免疫应答中起重要作用。在体外扩增的抗原特异性CD4+CD25hiFoxp3+Treg能诱导器官特异性免疫耐受，从而使移植物长期存活［6］。Foxp3基因在Treg的发育和功能维持中起着关键的作用［7］。通过逆转录病毒，将Foxp3基因转入CD4+CD25-T细胞，可以使后者上调CD25，CTLA4，GITR等分子，并具备Treg的功能特性。CD4+CD25-T细胞经Foxp3基因转染转型为功能性Treg细胞后，在获得抑制功能的同时，将不再分泌细胞因子IL2，IL4，IFNγ［8］。转染了Foxp3的CD4+CD25-T细胞对树突状细胞可以发挥抑制作用［9］。 蛋白转导结构域（protein transduction domain，PTD）能有效地引导多肽或蛋白质进入细胞，且转导速度快，效率高［10］，被PTD带入细胞的分子都还具有它们本来的活性。基于以上报道，本实验体外表达了带有穿膜序列的PTDmFoxp3。 将体外表达的PTDmFoxp3直接导入细胞，发挥生物学作用，克服了转Foxp3基因的操作复杂、表达不稳定、基因调控困难的缺点。我们在前期研究中将PTDmFoxp3与小鼠T淋巴细胞瘤EL4细胞系共育，经流式细胞术分析发现其具有高效穿膜功能，经混合淋巴细胞反应证实其具有抑制混合淋巴细胞反应的作用［4］。

　　淋巴细胞介导的细胞免疫应答在同种移植急性排斥反应中处于核心地位，能够抑制淋巴细胞活化和增殖即有可能抑制机体免疫反应。我们采用ConA活化的淋巴细胞增殖试验证实了PTDmFoxp3能有效地抑制小鼠脾淋巴细胞增殖反应；小鼠体内应用PTDmFoxp3后，移植皮片生存期明显延长，且能减轻移植组织周围的淋巴细胞浸润，其效果与CsA相当。这说明PTDFoxp3在体内抑制了T细胞活化增殖，降低了机体免疫反应。即经PTDFoxp3处理后的淋巴细胞表现了与转Foxp3基因后相似的免疫无能性。

　　经PTDmFoxp3转导后的淋巴细胞是否如转Foxp3基因后所表现的抑制NFκB和影响染色质的结构发挥抑制IL4基因的表达［11］，及是否影响了所转导的细胞表面标志的变化及细胞因子的表达等，这些尚有待进一步的研究。总之，PTDmFoxp3具有诱导T细胞表现出Treg的特点免疫应答无能性，为抗移植排斥反应提供了新的思路和用药方法。

参考文献

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