依达拉奉对兔肺缺血再灌注损伤的保护作用

【摘要】 　　目的：利用改良兔在体肺保护模型，探讨氧自由基清除剂依达拉奉对在体肺保护的作用及可能机制。方法： 健康家兔20只，随机分为低钾右旋糖酐液（LPD液）组与依达拉奉（LPE液）组，每组10只，分别以LPD液和LPE液进行肺动脉灌洗和保存，每组分别于等时点取左下肺静脉血行血气分析检测静脉血氧分压（PvO2），测定血浆丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS），肺组织湿干重比(W/D)，光镜、透射电镜下观察肺组织形态结构变化。结果： 两组动物再灌注后各时点PvO2均较缺血前下降，但LPE液组明显高于LPD液组，再灌注后LPE液组血浆MDA、iNOS表达明显低于LPD液组，SOD、eNOS表达则高于LPD液组，肺组织湿干重比LPE液组明显低于LPD液组，组织形态学检查LPE液组结构损伤变化较LPD液组轻。结论： 加入依达拉奉的LPD液能够减轻肺缺血再灌注损伤，具有较好的肺保护效果。

【关键词】 依达拉奉； 肺缺血再灌注； 保护作用； 兔

　　［Abstract］Objective: To investigate the preservative effect of edaravone on rabbits lung ischemiareperfusion injury.Methods： Twenty rabbits were randomly pided into two groups. In LPD group，the lungs were perfused and preserved with LPD solution，while in LPE group，the lungs were with LPD+Edaravone solution.In reperfusing the blood samples were got at the same time.The PvO2，iNOS，eNOS，SOD and MDA，lung wet/dry weight ratio were detected.Lung samples were examined by pathology. Results： At the same time，the PvO2 was higher in the edaravone group than that in the LPD group.The levels of eNOS and SOD were higher in the edaravone group than that in the LPD group，while the levels of MDA and iNOS were lower in the edaravone than that in LPD group.The wet/dry weight ratio was significantly lower in Edaravone group than that in LPD group. Conclusion： Edaravone could help in clearing of oxygen free radical and result in alleriating of lung ischemiareperfusion injury. Edaravone had positive effect on preservative quality of the ischemiareperfusion lung.

　　［Key words］edaravone; lung ischemiareperfusion; preservative effect; rabbit

　　随着移植相关各项技术的更新和发展，肺移植已成为治疗终末期肺气肿、晚期肺实质性病变和肺血管病变唯一有效的方法，但手术后早期的肺缺血再灌注损伤仍是患者术后发生肺功能不全导致死亡的重要原因。肺缺血再灌注损伤的重要原因之一就是氧自由基形成。依达拉奉是一种新型的自由基清除剂，对多种脏器及组织的缺血再灌注损伤有保护作用。本研究拟通过建立兔在体肺保存模型，探讨依达拉奉对肺损伤的保护作用及可能机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物分组

　　健康家兔20只，雌雄不限，体质量2 500～3 000 g，由江苏大学实验动物中心提供，随机分为低钾右旋糖酐液（LPD液）组和依达拉奉（LPE液）组，每组10只，分别以LPD液和加入依达拉奉的LPD液进行肺动脉灌洗和保存。LPD液配制成分（Na+ 141 mmol/L，K+ 6.4 mmol/L，Cl- 119 mmol/L，Mg2+5 mmol/L，葡萄糖10 g/L，低分子右旋糖酐10 g/L，胰岛素20 U/L），LPE液组在LPD液中加入依达拉奉0.05 mg/ml。
　　
　　1.2 材料
　　
　　动物人工呼吸机DH140（浙江医科大学动物实验仪器厂）；多功能心电监护仪；多道生理信号采集处理器（四川生理仪器厂）；台式离心机（上海安亨科学仪器厂）；电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；电热恒温干燥箱（上海山连实验设备有限公司）；血气分析仪（美国IL公司GEMpremier 3000）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）试剂盒（南京建成生物公司）；内皮型一氧化氮合酶（eNOS）试剂盒（美国ADL生物公司）；依达拉奉注射液（南京先声药业东元制药有限公司）。
　　
　　1.3 自制改良兔在体肺保存模型的建立
　　
　　盐酸氯胺酮30 mg/kg麻醉，切开气管、呼吸机机械通气。呼吸参数：频率40次/min，吸呼比1∶1，氧浓度21%，潮气量15 ml/kg。剪断第3～6肋软骨和腋后线肋骨显露左侧胸腔内器官，全身肝素化。切除左上肺叶，游离左肺动脉肺门部，过七号线套左肺门根部组织（左肺动脉除外）并套管待阻断，经主肺动脉分支左右肺动脉处过线套管待阻断，左房壁缝荷包，穿刺置管入左下肺静脉，固定，从主肺动脉直接置肺动脉灌注管至左肺动脉，阻断左肺动脉，在左肺中度通气状态下收紧肺门线，阻断肺门，降低潮气量至10 ml/kg。两组均自灌注管灌入4℃肺保护液，经左下肺静脉内穿刺管引流。肺灌注压15 mmHg，以重力为动力，灌注总量60 ml/kg，灌注完毕后将肺放入10℃低温自制肺保存器内，维持上述通气1 h，移去肺保存器，松开肺门及左肺动脉再灌注2 h。术中自股动脉置管，监测生命体征。

　　1.4 标本采集

　　（1）在缺血前，再灌注1，2 h取左下肺静脉血作血气分析检测静脉血氧分压（PvO2）；（2）缺血前，再灌注30，60，90，120 min取左下肺静脉血检测MDA，SOD，iNOS，eNOS；（3）切取标本：手术结束前取左下肺相同部位组织两块，1块(0.5 cm×0.5 cm ×0.5 cm大小)用10%甲醛固定，切片，苏木素－伊红染色，光镜观察肺组织结构变化。另1块(0.2 cm×0.2 cm×0.2 cm大小)用戊二醛、锇酸固定，树脂包埋，制作超薄切片，透射电镜观察组织超微结构变化。(4)取左下肺相同部位组织约0.5 g，称湿重，在70℃下烘48 h称其干重，计算肺湿干重比（W/D），检测肺水肿情况。

　　1.5 统计学处理

　　计量资料以均数±标准差（±s） 表示，组间比较采用两样本均数t检验，组内比较采用方差分析，运用SPSS11.5统计软件分析，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 肺静脉血PvO2测定结果

　　两组动物缺血再灌注前PvO2值差异无统计学意义，再灌注1， 2 h PvO2值均低于缺血前值，但LPE液组明显高于同时点LPD液组。见表1。表1 两组各时点PvO2测量结果（略）

　　2.2 血浆MDA，SOD，iNOS，eNOS测定结果

　　缺血前两组血浆MDA，SOD，iNOS，eNOS值差异无统计学意义。再灌注后各时点MDA，iNOS值高于缺血前，但LPE液组明显低于同时点LPD 液组；再灌注后各时点SOD，eNOS值低于缺血前值，但LPE液组均高于同时点LPD液组。见表2。表2 两组各时点MDA，SOD，iNOS，eNOS测定结果（略）

　　2.3 肺组织湿干重比

　　LPD液组和LPE液组肺组织湿干重比分别为5.09±0.13和4.9±0.22，LPE液组低于LPD 液组（P&<0.05）。

　　2.4 肺组织光镜、透射电镜检查

　　光镜下可见LPD液组部分肺泡萎陷，肺间质水肿，肺泡间隔有较多炎细胞浸润，微血管扩张，血管内皮细胞水肿（图1a）。LPE液组肺泡结构尚清晰，肺泡壁结构尚完整，局部肺泡上皮细胞轻度肿胀，血管内皮细胞结构保持完整，肺间质内可见少许炎细胞浸润，小血管扩张充血（图1b）。

　　3 讨论

　　20世纪80年代中期，McCord［1］提出了缺血再灌注损伤的概念，自由基在组织缺血再灌注损伤中的作用得到重视。正常生理状态下，自由基生成与清除处于动态平衡，肺缺血再灌注损伤造成自由基大量生成，引起生物膜上不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，使生物膜结构和功能遭到破坏，导致肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，致使肺渗出和水肿，引起肺功能损伤。因此，有效清除自由基是减轻移植肺缺血再灌注损伤的靶点之一。

　　依达拉奉是一种新型自由基清除剂，能够抑制自由基对脑细胞、血管内皮细胞和神经细胞的氧化损伤，对脑、心脏、肾脏、肢体等多种脏器及组织的缺血再灌注损伤有保护作用。研究显示，依达拉奉可通过预防线粒体过氧化应激和改善肝脏缺血后再灌注时的能量代谢，保护线粒体免受损伤，并预防内毒素引起的肝损伤，减少细胞凋亡［2］。在前期的研究中，我们观察了依达拉奉对脂多糖导致的兔急性肺损伤的保护作用，发现依达拉奉抗自由基作用显著，对急性肺损伤保护作用明显［3］。本研究结果显示肺组织湿干重比，LPE液组低于LPD液组，说明依达拉奉能够减轻肺水肿，减轻肺缺血再灌注损伤。

　　SOD是机体的内源性抗氧化剂，其活性水平的高低能间接反映机体清除自由基的能力［4］；MDA含量的测定常用来反映脂质过氧化程度，间接地反映出细胞损伤的程度［5］。本研究结果显示，再灌注后LPE液组和LPD液组各时点SOD低于缺血前，但同时点前者均高于后者；再灌注后LPE液组和LPD液组各时点MDA高于缺血前，但前者明显低于后者，提示依达拉奉可以明显增加SOD表达，降低MDA含量，可提高机体氧自由基清除能力，抑制脂质过氧化，保护肺血管内皮细胞，减轻肺缺血再灌注损伤。

　　NO是具有神经毒性的自由基，体内NO的含量及生物学作用依赖于一氧化氮合酶（NOS）的活性。NOS有神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)三种异构体［6］。肺内主要是eNOS和iNOS，在生理情况下只有eNOS处于催化合成NO的状态，表达的NO浓度低而恒定，对机体调节肺血管紧张度和肺动脉压、松弛支气管平滑肌、抑制血小板聚集制，阻断RNA的剪接，降解DNA，破坏核结构，诱导细胞向外发出信号以便被周围的细胞吞噬；再由启始因子激活级联下游的Caspase效应分子，最终由效应分子特异地水解细胞中的一系列底物而导致细胞解体，并包裹形成凋亡小体。因此，Caspase家族是直接导致凋亡细胞解体的蛋白系统，在细胞凋亡的分子机制网络中居中心地位，其活化是细胞凋亡通路的中心环节［2］。

　　脑缺血后，Caspase3 蛋白及其mRNA表达增加。由于Caspase3参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程，因此，阻断或减少Caspase3激活，降低Caspase3活性，皆可减轻由Caspase3介导的缺血性神经元损害［3］。Caspase3的抑制剂可显著抑制缺血易损伤区Caspase3的活性，阻止靶蛋白的裂解，从而抑制神经细胞的凋亡，改善神经功能［4］。

　　本实验研究表明，脑心康片具有明显的抗脑缺血作用，对神经元细胞Caspase3 mRNA表达有明显的抑制作用。高剂量脑心康片的抗脑缺血作用优于银杏叶片，与尼莫地平作用相当；中剂量脑心康片抗脑缺血的作用弱于尼莫地平，但与银杏叶片作用相当。

　　课题组的前期研究结果表明，脑心康片通过诱导bcl2的表达、抑制bax的表达而抑制脑缺血引起的细胞凋亡。因此，我们推测脑心康片可能是通过诱导bcl2的表达、抑制bax的上调从而阻止Caspase级联反应的激活，抑制Caspase3 mRNA及蛋白的表达，终止Caspases级联反应，也可能是直接抑制Caspase3 mRNA的表达，抗缺血性脑损伤后神经细胞凋亡。其抗脑缺血的其他相关机制尚待进一步研究证明。

参考文献

　　［1］Li Y， Chopp M， Powers C， et al. Apoptosis and protein expression after focal cerebral ischemia in rat ［J］. Brain Res， 1997， 765（2）: 301-312.

　　［2］An S，Hishikawa Y，Koji T，et al. Induction of cell death in rat small intestine by ischemia reperfusion: differential roles of Fas/Fas ligand and Bcl2/Bax systems depending upon cell types ［J］. Histochem Cell Biol， 2005， 123（3）: 249-261.

　　［3］Chang HY，Yang X. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases ［J］. Microbiol Mol Biol Rev， 2000， 64（4）: 821-846.

　　［4］Gorman AM， Orrenius S， Ceccatelli S. Apoptosis in neuronal cells: role of caspase ［J］. Neuroreport， 1998，9(10): R49-R55.