人类β1，3半乳糖基转移酶7对人4IgB7H3的修饰作用初探

　　 作者：唐春花， 马震宇， 岳爱环， 行书丽，蒋俊华　张昊 曹静媛， 周迎会，吴士良

【摘要】 目的： 探讨人4IgB7H3基因转染人胃癌细胞株SGC7901后人类β1，3半乳糖基转移酶7（β1，3galactosyltransferase 7，β3GalT7）的表达变化，以期发现4IgB7H3与β3GalT7的相互关系。方法： 脂质体介导重组逆转录病毒载体pEGZTerm/4IgB7H3转染SGC7901细胞，筛选获得稳定表达4IgB7H3的亚克隆细胞株，通过RTPCR和蛋白质印迹方法检测β3GalT7的表达。结果： 成功获得稳定表达4IgB7H3的亚克隆细胞株SGC7901/4IgB7H3；β3GalT7随4IgB7H3的表达上调而上调。结论： 4IgB7H3蛋白的修饰成熟可能需要β3GalT7的作用。

【关键词】 4IgB7H3； β1，3半乳糖基转移酶7； SGC7901； 转染

　　［Abstract］ Objective: We researched the change of UDPGal:betaGlcNAc beta 1，3galactosyltransferase polypeptide 7 expression in SGC7901/4IgB7H3 cell to find the relation between 4IgB7H3 and β3GalT7. Methods： Transfered pEGZTerm/4IgB7H3 into SGC7901 cell， then detected the expression of UDPGal:betaGlcNAc beta 1，3galactosyltransferase polypeptide 7 with RTPCR and Westernblotting. Results： SGC7901/4IgB7H3 cell line were successfully obtained. The expression of β3GalT7 was upregulated follow the upregulation of 4IgB7H3 on mRNA and protein level. Conclusion： UDPGal:betaGlcNAc beta 1，3galactosyltransferase polypeptide 7 may modify 4IgB7H3 protein.

　　［Key words］ 4IgB7H3； β1，3galactosyltransferase 7； SGC7901； transfer

　　共刺激分子(costimulatory molecules)B7H3最早报道于2001年，由Dong等［1］从人类树突状细胞来源的cDNA文库克隆而来，为新近发现的B7家族的成员。该基因位于人15号染色体上，由7个外显子和6个内含子组成，为I型跨膜糖蛋白，相对分子质量为45～110 kDa，编码361～534个氨基酸，属Ig家族。其蛋白包括N端信号肽，IgV样区、IgC样区、跨膜区和一个45个氨基酸的胞质尾［2］。

　　由于mRNA的剪接方式不同，B7H3有2IgB7H3和4IgB7H3两种剪接体，研究发现人的组织主要表达4IgB7H3，部分组织也表达2IgB7H3，而小鼠则只有2IgB7H3［2］。B7H3 mRNA在人类组织中广泛表达，在多种正常和肿瘤组织中均有表达［3］。在非淋巴样组织，如心、肝、肺、胎盘、前列腺、胰腺、小肠、结肠中高表达，在脑、骨骼肌、肾等组织中表达较低，许多淋巴组织如脾、淋巴结、骨髓、胸腺、胎肝中也有表达。B7H3 mRNA在一些肿瘤细胞系如黑色素瘤细胞系G361、宫颈癌细胞系HelaS3、白血病细胞系K562中有表达，在胃癌和胃腺瘤细胞膜、细胞质中均可见B7H3阳性表达。但外周血白细胞未见其表达，经过IFNγ刺激的DC和经过GMCSF刺激的单核细胞上可诱导B7H3的表达［4］。近年来越来越多的研究表明，共刺激分子的调节性表达、相互作用及其信号传递在非常复杂的肿瘤免疫应答过程中起着极其重要的作用。B7家族是最具有代表性的共刺激分子，作为惟一能从抗原递呈细胞(APC)单向传递信号至T细胞的共刺激分子，B7家族成员在肿瘤中的作用引起学者的普遍关注。

　　人类β1，3半乳糖基转移酶7（β1，3galactosyltransferase 7，β3GalT7）是利用TBLASTN信息途径，以信息探针β3GalT1（基因库登入号：AF117222）在NCBI的EST数据库中进行同源筛选，并从人肺cDNA文库中克隆到的人类β3半乳糖基转移酶家族中的一个新成员［5］。它的蛋白序列和其他β3GalT7有很高的同源性，并且在小鼠和大鼠中发现了其存在的证据。该家族在哺乳动物的生殖、发育、消化、肥胖、高血压发病、肿瘤发生等生理及病理过程中发挥作用，尤其在肿瘤的浸润转移过程中起着非常关键的作用［6］。 我们构建了能稳定表达人4IgB7H3基因的SGC7901基因转染细胞株，并初步探讨了4IgB7H3与β3GalT7的相互关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　逆转录病毒载体pEGZTerm及2个辅助病毒载体pHIT456 和pHIT60 由德国Sefling教授惠赠，重组表达质粒pGEZTerm/4IgB7H3由苏州大学生物技术研究所构建保存；细胞株293T购自美国ATCC，SGC7901由本室保存；培养细胞所用的RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；小量质粒抽提试剂盒购自北京天根公司；Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒和抗性筛选药物Zeocin购自美国Invitrogen公司；Polybrene购自美国Sigma公司；RTPCR试剂盒购自Promega公司；PE羊抗鼠IgG二抗购自上海晶美公司；抗人B7H3 单克隆抗体21D4为苏州大学医学生物技术研究所研制；β3GalT7多克隆抗体为本实验室研制。引物设计采用Genetyx软件，并经基因库Blast进行同源检索后合成。引物由Invitrogen公司合成。β3GalT7 上游：5′TGCCCTTTGCTTACTGG3′，下游：5′GGTCTTTGAGCGTCTGGT3′，预期扩增产物长度474 bp；4IgB7H3上游:5′ACCATCACAGGGCAGCCTAT3′，下游:5′TCCTCAGCTCCTGCATTCTC3′，预期扩增产物长度155 bp；β肌动蛋白上游：5′CATGTACGTTGCTATCCAGGC3′，下游：5′CTCCTTAATGTCACGCACGAT3′，预期扩增产物长度250 bp。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 含4IgB7H3基因的重组逆转录病毒颗粒的包装 经鉴定正确的阳性克隆在LB液体培养基中扩增培养，大量质粒抽提试剂盒抽提重组表达质粒pGEZTerm/4IgB7H3，尽可能保持无菌，-80℃冻存。将重组逆转录病毒载体pEGZTerm/4IgB7H3与2个辅助病毒pHIT456 和pHIT60 按2∶1∶1 的比例用脂质体法共转染6 孔板中60%～70%汇片且生长旺盛的293T包装细胞。细胞转染48 h 后，收集少量293T细胞，用倒置荧光显微镜检测报告基因绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况，计算转染效率。同时包装制备阴性对照的逆转录病毒pGEZTerm。

　　1.2.2 表达人4IgB7H3抗性细胞株的感染和筛选 收集含逆转录病毒颗粒的293T细胞培养上清， 感染6孔板中50%左右生长汇片的SGC7901细胞，同时加入polybrene 使其终浓度为8 ng/ml，37℃感染6 h，添加10% FCS的1 640培养基至2 ml/孔，隔天换液，重复感染3次后，收集细胞，按1∶10稀释，将其置于含Zeocin(500 μg/ml)的选择性培养基中，筛选培养2周，待抗性单克隆集落长出，用尖头吸管吹去表面死细胞和生长状态较差的细胞，继续筛选5 d，使抗性克隆长至足够大，挑取单克隆集落，进行扩大培养。同时制备阴性对照的基因转染细胞SGC7901/Mock。

　　1.2.3 转染稳定细胞株鉴定 (1)SGC7901/4IgB7H3细胞中GFP报告基因的荧光检测：将获得的基因转染细胞进行扩增培养，以SGC7901亲本细胞为对照，用荧光显微镜在507 nm激发波长下检测SGC7901基因转染细胞中GFP报告基因的稳定表达情况。(2) RTPCR法检测SGC7901/4IgB7H3细胞中目的基因的转录：①收集Zeocin筛选获得的基因转染细胞1×107，用Trizol抽提其总RNA，按照MBI逆转录试剂盒操作手册将mRNA逆转录成cDNA，再取5 μl cDNA为模板，用前述4IgB7H3特异性引物扩增4IgB7H3基因，同时用SGC7901和SGC7901/Mock细胞作阴性对照。PCR反应条件：95℃预变性3 min；95℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 10 min。②琼脂糖凝胶电泳记录结果：取PCR产物10 μl和上样缓冲液5 μl混合上样，与Mix DNA标准参照物一起在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离后，溴化乙啶染色15 min，图像分析仪UVP摄像并分析结果。(3) 4IgB7H3蛋白表达量检测：收集SGC7901/4IgB7H3和SGC7901/Mock细胞，以SGC7901亲本细胞为对照，提取蛋白进行蛋白质印迹检测4IgB7H3蛋白的表达情况。

　　1.2.4 RTPCR检测转染细胞β3GalT7基因 收集Zeocin筛选获得的基因转染细胞1×107，用Trizol抽提其总RNA，按照MBI逆转录试剂盒操作手册将mRNA逆转录成cDNA，再取5 μl cDNA为模板，用前述特异性引物扩增各基因，同时用SGC7901和SGC7901/Mock细胞作阴性对照。

　　1.2.5 转染细胞基因β3GalT7的蛋白检测 收集SGC7901/4IgB7H3和SGC7901/Mock细胞，以SGC7901亲本细胞为对照，提取蛋白进行蛋白质印迹检测β3GalT7基因的蛋白表达情况。

　　1.2.6 统计学分析 使用Sigma Scan Pro5图像分析软件扫描核酸电泳图和蛋白质印迹图片；GraghPad Prism 4统计分析软件进行统计学分析并绘制柱形图，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 基因转染稳定细胞株鉴定

　　2.1.1 SGC7901/4IgB7H3细胞中GFP报告基因的荧光检测 将获得的基因转染细胞进行扩增培养，以SGC7901/Mock和SGC7901亲本细胞为对照，用荧光显微镜在507 nm激发波长下检测SGC7901基因转染细胞中GFP报告基因的稳定表达情况（图1）。

　　2.1.2 RTPCR法检测SGC7901/4IgB7H3细胞中目的基因的转录 用Trizol试剂盒抽提SGC7901/4IgB7H3细胞的总RNA，经RTPCR方法检测4IgB7H3 mRNA的转录，结果显示SGC7901/4IgB7H3中能扩增出大小约为155 bp的特异性片段（图2），且相对于空白对照组SGC7901，其表达量明显升高，P&<0.01（图3），表明导入的外源性人4IgB7H3基因已整合到SGC7901细胞基因组中并能很好地转录成相应的mRNA。

　　2.1.3 转染细胞4IgB7H3蛋白表达量检测 收集稳定表达的亚克隆细胞，以SGC7901亲本细胞为对照提取蛋白进行蛋白质印迹检测4IgB7H3蛋白的表达情况，发现SGC7901/4IgB7H3的4IgB7H3蛋白表达量明显比SGC7901细胞的蛋白表达量高(P&<0.05)，而SGC7901/Mock细胞的蛋白表达量与SGC790细胞相比，则无明显差异（图4，图5），说明SGC7901/4IgB7H3细胞能稳定高表达4IgB7H3蛋白，其蛋白的相对分子质量约为110 kD，略大于氨基酸理论值，这可能是由于蛋白质翻译后的糖基化所致。

　　2.1.4 RTPCR检测转染细胞检测β3GalT7基因 将３组细胞SGC7901，SGC7901/Mock及SGC7901/4IgB7H3细胞分别抽提RNA进行逆转录PCR分析。以βactin为内对照，分别检测3种细胞的β3GalT7(474 bp) mRNA表达水平。其结果显示，相对于空白对照细胞SGC7901，SGC7901/4IgB7H3细胞株β3GalT7 mRNA量略有升高(P&<0.05)，而SGC7901/Mock细胞株的β3GalT7(GnT8) mRNA表达量相对于空白对照没有明显变化（图6，图7）。

　　2.1.5 蛋白质印迹检测β3GalT7蛋白表达结果 将3组细胞SGC7901，SGC7901/Mock及SGC7901/4IgB7H3细胞分别抽提蛋白，以βactin为内对照进行蛋白质印迹分析，检测β3GalT7蛋白表达量变化。其结果显示，SGC7901/4IgB7H3细胞株相对于空白对照的SGC7901细胞株其β3GalT7蛋白表达量略有升高 (P&<0.05)，SGC7901/Mock 细胞株的β3GalT7蛋白表达量相对于空白对照没有明显变化（图8，图9）。

3 讨 论

　　胃癌的发病率占全部恶性肿瘤的第3位，占消化道肿瘤的首位。我国每年死于胃癌约16万人［7］。B7H3对胃癌细胞的影响，目前尚鲜有相关报道。T细胞的有效活化依赖于双信号，一是抗原肽MHC复合物，由TCR识别；二是共刺激信号(costimulating signal)，由一系列共刺激分子参与，并影响T细胞的活化、增殖及细胞因子分泌［8］。B7家族是最重要的共刺激分子家族之一。近几年，陆续发现了一些新的B7家族成员，如PDL1，PDL2，B7h3，B7H3，B7H4［4，9-12］，这些新成员的特异性受体、作用机制及在免疫应答中的作用已成为目前研究的热点。令人感兴趣的是，B7H3在啮齿类动物中仅有单个的IgVIgC样区称为2IgB7H3，而在人类中除了2IgB7H3，还存在具有两个IgVIgC样区的4IgB7H3［2］。RTPCR的结果显示4IgB7H3有着广泛的表达，而在人的THP1，HUVEC细胞株以及胎盘中并没有发现2IgB7H3的PCR产物［13］，提示4IgB7H3在细胞和器官中可能占主导地位。作为惟一能从抗原递呈细胞(APC)单向传递信号至T细胞的共刺激分子B7家族的成员之一， 4IgB7H3在肿瘤中的作用，特别是在肿瘤免疫应答中的作用至关重要。

　　长期以来， 人们热衷于基因工程和蛋白质工程的研究， 认为糖类主要是作为生物的能量来源和结构物质。现在看来， 大多数蛋白质以糖蛋白形式存在， 它们包括酶、免疫球蛋白、载体蛋白、激素、毒素、凝集素和结构蛋白， 功能涉及细胞识别、信息传递、激素调节、受精、发生、发育、分化、神经系统和免疫系统恒态［14］维持等各个方面 。病菌、病毒的侵染， 癌细胞的增殖及转移， 自身免疫疾病［15，16］等都与细胞表面的糖密切相关 。研究发现在肿瘤细胞中聚乙酰半乳糖胺及功能性寡聚sialylLex，diLex 增多，它们促进肿瘤的浸润转移［6］。这些功能性寡聚糖除了由在核2支链O聚糖合成外，也可以由核1在β3GnT的作用下延伸而成。

　　既然B7H3蛋白为糖蛋白，那么，其蛋白质在肽链合成的同时或合成后，必然会经过这样的过程：在糖基转移酶的催化下，各种糖链被连接到肽链上特定的糖基化位点，从而形成成熟的功能完善的蛋白质。作为免疫共刺激分子B7家族的成员之一，B7H3分子在机体免疫过程中扮演着第二信号的重要角色，信号传递是其功能中十分重要的部分，而蛋白质表面的糖链结构正与信号转导息息相关，影响着细胞信号转导的多个环节。基于此，我们大胆猜测，人β3GalT7是否也参与了B7H3蛋白的修饰成熟过程？人4IgB7H3作为B7H3的两种剪切体之一，其蛋白质在成熟过程中很可能会受到人β3GalT7的催化作用而被糖基化修饰。通过以上工作，成功构建了人胃腺癌细胞SGC7901的4IgB7H3基因正调控模型，为研究两种基因间的相互关系提供了物质基础。

　　以构建好的细胞模型为桥梁对两种基因间的相互关系作初步研究，我们发现，在mRNA表达水平上，随着4IgB7H3基因表达上调，人β3GalT7(GnT8)基因的表达略有上升，两种基因的表达呈正相关；同时，在蛋白表达水平上，也存在这样的正相关关系。提示，这两种基因间可能存在相互作用。可以推测：4IgB7H3的高表达，可能需要更多β3GalT7(GnT8)蛋白来对其进行翻译后的成熟修饰。然而关于两者之间的关系研究，还需要从各个角度和层面展开工作。在接下来的工作中，我们将继续探讨人β3GalT7(GnT8)蛋白与人4IgB7H3蛋白间的相互作用，期望能为两者间关系的研究提供一些依据。

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