7硝基吲唑对深低温停循环大鼠的脑保护作用

　　　　 作者：刘尊涛， 陈锁成， 韩家付， 陈明治

【摘要】 目的： 探讨神经元型一氧化氮合酶（nNOS）在深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest，DHCA）大鼠中的脑损伤作用。方法： 154只健康SD大鼠随机分为4组：假手术组、DHCA组、7硝基吲唑（7NI）组和花生油组，后3组再分为DHCA术后2，6，12和24 h 4个亚组。假手术组与24 h亚组各16只大鼠，其余亚组各10只大鼠，冰块包埋体温降至21℃时阻断双侧颈总动脉建立DHCA模型。观察特异性nNOS抑制剂7NI对脑水肿，脑组织光镜、电镜结构和脑组织丙二醛含量的影响。结果： 与DHCA组相比，7NI能减轻脑水肿（P&<0.05），改善脑细胞形态，并能降低丙二醛含量（P&<0.05）。结论： nNOS在DHCA脑损伤中起细胞毒性作用，7NI有希望延长DHCA安全时限。

【关键词】 深低温停循环； 一氧化氮； 一氧化氮合酶； 7硝基吲唑

［Abstract］ Objective: To investigate the function of neuronal nitric oxide synthase(nNOS) in deep hypothermic circulatory arrest. Methods： One hundred and fiftyfour SD rats were randomly pided into 4 groups: fake operation group(n=16)， DHCA group(n=46)， 7nitroindinazole(7NI) group(n=46)， arachisoil group(n=46). The last 3 groups were each pided into 4 subgroups according to the time phase after DHCA， which was 2 h(n=10)， 6 h(n=10)， 12 h(n=10)， 24 h(n=16). Imbedding rats by ice cubes to reduce the temperature and occlusion both common carotid arteries while the temperature reach 21℃. The effect of nNOS inhibitor 7NI on ischemia edema， structure and contents of MDA in cerebral were studied. Results： 7NI significantly lessened ischemic edema(P&<0.05)， improved neuronal cell degeneration， decreased MDA content of the brain.(P&<0.05). Conclusion： nNOS may act as a neurotoxic mediator in DHCA， and 7NI may be used to prolong time limited of DHCA.

　　［Key words］ DHCA； NO； NOS； 7NI

　　自1975年Griepp等［1］首次应用深低温停循环(deep hypothermic and circulatoryarrest， DHCA)进行主动脉弓替换成功后，ＤＨＣＡ广泛应用于大血管及复杂先天性心脏病手术中。但DHCA 安全时间有限，超过45 min对中枢神经系统会造成严重损伤［2］，严重制约着手术的圆满完成。停循环对脑组织的损伤作用是多方面的，近年来一氧化氮(NO)在脑缺血中的作用日益受到重视，但不同的动物实验及临床研究结果分歧很大。近来研究认为不同类型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）产生的NO在脑缺血中的作用可能不同［3］。本实验通过观察特异性神经元型NOS(nNOS)抑制剂7硝基吲唑(7nitroindinazole，7NI) 对大鼠脑缺血-再灌注损伤的影响，探讨nNOS在脑缺血中的作用。

1 材料与方法

　　1.1 动物及分组

　　健康SD大鼠154只，雌雄不拘，体质量200～250 g，由江苏大学医学院实验动物中心提供。随机分为4组：假手术组、DHCA组、7NI组和花生油组。假手术组16只；其余3组各46只，每组再分为DHCA术后2，6，12和24 h共4个亚组，其中24 h亚组16只，另外每个亚组各10只；假手术组及24 h组各取6只用于测定脑水肿，其余用做生化指标检测及电镜观察。

　　1.2 试剂及用法

　　7NI及花生油购于深圳晶美生物工程有限公司， 丙二醛（MDA）含量检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所。实验当天，7NI按动物体质量25 mg/kg溶于花生油中，配成悬浮液。深低温停循环前30 min腹腔注射7NI或等量花生油。

　　1.3 建立实验动物模型

　　实验组SD大鼠称重，阿托品0.02 mg/kg肌肉注射，深部皮下注射肝素1 000 U/kg肝素化，30 min后按100 mg/kg腹腔注射氯胺酮麻醉。从正中打开颈外肌层，分别向左右沿颈外斜肌间隙分离筋膜，找到颈总动脉，从伴行的神经旁游离出动脉并套上丝线，用纱布盖好切口。用剪刀纵行剪开皮肤，打开腹股沟管，找到股动脉，动脉置管，用肝素填充连接管后接压力换能器，多通道生理监护仪监测血压、心率。用涂有石蜡油的温度计插入肛门5 cm，监测肛温(大鼠的体温和脑部基本近似，通过对大鼠深部温度检测来估计脑部的温度)。在大鼠尾巴的根部缠绕血氧饱和度探头，检测外周血氧饱和度。最后用冰块袋包埋大鼠，物理降温，每隔5 min记录体温、心率、血压以及血氧饱和度，调整降温速度。当肛温降至21℃时停止降温，用动脉夹阻断两侧颈总动脉，使体温维持在(21±1)℃之间，并记录体温、心率、血压以及血氧饱和度。60 min后恢复颈总动脉血流。置大鼠于早产儿培育箱复温，在2 h内将体温恢复到38.5℃，维持正常体温2 h后放置室温下正常饲养。各组分别取6只于相应时间点处死，取脑放入-80℃冰箱保存。

　　1.4 测定脑水肿

　　假手术组及24 h组各取6只断头处死，快速取脑在电子天平上称重为湿重，80℃烘箱烘干48 h至恒重后称重为干重。

　　脑组织水质量分数=湿重-干重湿重×100%

　　1.5 MDA检测

　　先将标本制成匀浆，低温离心，蛋白定量，按照试剂盒说明书操作步骤测定脑组织中MDA含量。

　　1.6 电镜、光镜观察

　　各组分别于相应时间点，断头处死动物，快速取左大脑半球距前极4 mm后额顶背外侧皮质约1 mm×1 mm×1 mm，2.5％戊二醛溶液固定，1%锇酸固定，乙醇和丙酮递增浓度脱水，环氧树脂包埋，超薄切片经铅铀双染后，在透射电镜下观察、摄片。同时取右侧大脑半球，10%中性甲醛缓冲液固定，切点取自视交叉、乳头体中部、大脑后缘与小脑连接处，将脑行冠状切片，常规石蜡包埋切片6 μm， HE染色，作光镜检查。

　　1.7 统计学处理

　　所有实验数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，选用方差分析， 组间两两比较用q检验，以P&<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 7NI对脑水肿的影响

　　DHCA组脑组织水质量分数［（79.51±1.08）%］显著高于假手术组［（78.02±0.70）%］，P&<0.05。与DHCA组比，7NI组［（78.21±0.65)%］能显著降低脑组织水质量分数，P&<0.05。花生油组［（79.77±1.25）%］则对脑水肿无影响，见图1。

　　2.2 MDA含量检测结果

　　深低温停循环再灌注后DHCA组、7NI组MDA含量较假手术组均升高，DHCA 后2 h MDA含量最高，随后逐渐降低。但7NI组各时间点MDA含量均明显低于DHCA组，差异有统计学意义，见表1。

　　2.3 电镜观察结果

　　假手术组神经细胞超微结构正常;DHCA组神经元胞体固缩，核固缩或溶解坏死，染色质聚集成块，呈环状排列于核膜内缘，似有凋亡小体形成，线粒体肿胀明显，高尔基复合体扩张，膜结构空泡化；7NI组上述神经组织的异常改变明显改善，核轻度不规则，核膜完整，异染色质分布较均匀，粗面内质网、线粒体基本正常（图2）。 表1 脑组织各时相MDA水平

　　2.4 光镜观察结果

　　DHCA组光镜下可见脑组织细胞肿胀，核固缩， 胞质大部分消失，甚至胞膜破裂，间质水肿，血管及组织周围间隙增大，脑组织水肿明显。7NI组损伤灶范围较DHCA组缩小，细胞形态改善，血管和组织周围间隙减小，脑水肿减轻（图3）。

3 讨 论

　　DHCA造成脑损伤的机制复杂，众多的研究发现氧自由基、NO、兴奋性氨基酸、钙离子超载等因素均参与细胞凋亡、坏死的发生［4］。NO因其在脑损伤中的双重作用而备受关注。体内NO主要由内皮细胞、神经细胞和神经胶质细胞内NOS催化合成，根据基因编码、组织和细胞来源将NOS分为3种亚型：神经元型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)。脑内NOS合成NO时需要分子氧的活化，而分子氧活化是由位于NOS酶催化中心的修复族亚铁血红素来完成的，7NI可抑制NOS酶中心的亚铁血红素，从而抑制h3O2和超氧阴离子的产生。体外试验中7NI为NOS亚型非选择抑制剂，但在生物体内7NI易通过血脑屏障却很难进入内皮细胞，因此7NI对nNOS有特异性抑制作用［5］。本实验于DHCA模型建立前30 min腹腔注射7NI。与DHCA组比较，7NI显著减轻DHCA后24 h脑水肿，Perier等［6］根据脑水肿变化规律，推测最初nNOS活性增加可能推进了脑水肿高峰形成，缺血后第二阶段脑损伤(即在基础损伤上出现好转数天后的损伤)和细胞水肿有很大关系。故应用7NI抑制nNOS不仅减轻急性期脑水肿，而且对于迟发损伤亦有抑制作用。

　　丙二醛是超氧阴离子自由基攻击体内不饱和脂肪酸等发生脂质过氧化反应生成的终末产物，可以反映脑组织中自由基的含量和脂质过氧化的程度，丙二醛升高提示自由基生成增多。本实验7NI组大鼠脑组织中丙二醛水平明显低于对照组，提示7NI抗氧化和抑制氧自由基产生是其脑保护作用的重要环节之一。电镜超微结构下DHCA组神经元结构破坏严重，核固缩或溶解坏死，染色质聚集成块，线粒体肿胀明显，膜结构空泡化，7NI组线粒体、内质网损伤程度明显减轻；光镜下DHCA组脑组织细胞肿胀明显，间质水肿较重，血管及组织周围间隙增大，7NI组损伤灶范围较上缩小，细胞形态改善，血管和组织周围间隙减小。由此可证明nNOS来源的NO对DHCA大鼠脑组织有毒性作用，与Haga等［7］实验结果基本一致。其作用机制可能是在脑缺血后表达过量的NO与超氧阴离子迅速反应，生成过氧化亚硝酸离子(ONOO-)，并进一步生成过氧亚硝酸或降解成超氧阴离子和NO2-，大量活性氧物质破坏了生物体内氧化与抗氧化平衡，导致细胞内蛋白质、核酸的损伤，膜脂质过氧化及血脑屏障损伤，加剧脑水肿，同时介导N甲基D天冬氨酸（NMDA）毒性，抑制线粒体呼吸酶；作用于DNA复制的限速酶核苷酸还原酶抑制DNA复制；直接作用于DNA使核酸脱氨基化，DNA链断裂，活化ADP核糖多聚酶，导致能量衰竭，细胞死亡。作为nNOS抑制剂，7NI可有效抑制NO的产生，减少氧自由基的合成，还可有效抑制缺氧缺血后兴奋性氨基酸的释放，抑制NMDA和其他谷氨酸受体的激活，减少钙离子内流，阻断核酸降解和细胞凋亡［8］。

　　7NI抑制nNOS的同时并不影响脑内葡萄糖的利用。Kelly等［9］用足够量的2［14C］脱氧葡萄糖检测脑血流量下降时脑内葡萄糖的利用，用7NI后无显著变化，提示7NI抑制nNOS时并不减少大脑能量供应。

　　综上，7NI对DHCA后的脑损伤发挥保护作用，为减轻DHCA术后并发症、延长DHCA安全时限提供了理论依据。然而7NI目前主要用于动物实验，尚未应用于临床，因此临床安全性及最佳的给药时间、给药剂量仍有待于进一步研究。

参考文献

［1］ Griepp RB，Stinson EB，Hollingsworth JF，et al.Prosthetic replacment of the aortic arch［J］. J Thorac Cardiovasc Surg，1975，70(9):1051-1063.

［2］ Young WL，Lawton MT，Gupta DK，et al. Anesthetic management of deep hypothermic circulatory arrest for cerebral aneurysm clipping［J］.Anesthesiology， 2002， 96（2）: 497-503.

［3］ Luchetti F， Canonico B， Curci R， et al.Melaton in prevents apoptosis induced by UVB treatment in U937 cell line ［J］. J Pineal Res， 2006， 40(2): 158-167.

［4］ Cherian L， Hlatky R， Robertson CS. Nitric oxide in traumatic brain injury［J］.Brain Pathol，2004，14（2）:195-201.

［5］ MorenoLopez B， RoneroGrinaldi C， Noval JA， et al.Nitric oxide is a physiological inhibitor of neurogenesis in the adultmouse subventricular zone and olfactory bulb［J］.J Neurosci， 2004，24(1): 85-95.

［6］ Perier C， Tieu K， Guegan C， et al. Complex I deficiency primes Baxdependent neuronal apoptosis through mitochondrial oxidative damage ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2005， 102(52): 19126-19131.

［7］ Haga KK，Gregory LJ，Hicks CA，et al. The neuronal nitric oxide synthase inhibitor， TRIM， as a neuroprotective agent: effects in models of cerebral ischaemia using histological and magnetic resonance imaging techniques. ［J］. Brain Res，2003，993(1/2):42-53.

［8］ Chen JY， Wang XM， Liu J， et al. Inhibitory effect of human brain myelin basic protein on h3O2induced apoptosis of human lung cancer cell line YTLMC90 ［J］. Ai Zheng， 2006， 25(2): 170-174.

［9］ Kelly PA， Ritchie IM， Arbuthnott GW，et al. Inhibition of neuronal nitric oxide synthase by 7nitroindazole: effects upon local cerebral blood flow and glucose use in the rat ［J］.J Cereb Blood Flow Metab， 1995，15(5):766-773.