【摘要】 目的 研究新型格列酮类化合物ANY2对原代大鼠前体脂肪细胞糖脂代谢的影响。方法 ①用Ⅱ型胶原酶消化法得到原代大鼠前体脂肪细胞接种于24孔细胞培养板，以诱导培养基诱导分化，油红O染色法观察化合物ANY2对前体脂肪细胞分化的影响，并用异丙醇萃取油红O测定吸光度，比较各组分化程度。②以高浓度地塞米松作用于分化的脂肪细胞，制备胰岛素抵抗模型，观察化合物ANY2对胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖消耗量(GC)和游离脂肪酸(FFAs)溢出量的影响。结果 浓度为1.1mg·L-1的化合物ANY2能显著促进前体脂肪细胞分化，分化率高达152%，提高其储脂能力，增加小脂肪细胞数量；提高胰岛素抵抗脂肪细胞糖耗量达363 mg·mg pro-1，减少其游离脂肪酸溢出，溢出量仅69 mmol·mg pro-1。结论 化合物ANY2可促进原代前体脂肪细胞分化充脂，并改善高浓度地塞米松所导致的胰岛素抵抗作用。
【关键词】 原代前体脂肪细胞；分化；脂肪酸溢出；胰岛素抵抗
Effect of Novel Thiazolidinedione ANY2 on Glycometabolism and Lipid Metabolism in Primary Precursor Adipose Cells
Abstract: Objective To investigate the effects of a novel thiazolidinedione ANY2 in primary precursor adipose cells.Methods 1.Using enzyme-digesting method，primary precursor adipose cells from the rat adipose tissues were cultured in 24wells Culture Plate.Using culture medium to induce the transformation of the cells and stained with oil red O to contrast the differentiation.2.Differentiaed cells were exposed to high concentration of dexamethasone to build model of Insulin resistance cells.The effects of ANY2，including glucose consumption (GC) and FFAs releastion were tested in this model.Results ANY2 could significantly promote the differentiation on primary precursor adipose cells，increase consumption of glucose［363mg·(mg·pro)-1］ and reduce FFAs releastion［69 mmol·(mg·pro)-1)］under the state of insulin resistance.Conclusion Compound ANY2 has remarkable effects on improving insulin resistence in adipose cells.
Key words:primary precursor adipose cells; differentiation; FFAs releastion ; insulin-resistance
脂肪组织具有重要的内分泌功能，由它产生众多的细胞因子和炎症因子，通过内分泌旁分泌和自分泌途径广泛影响机体物质和能量代谢过程，参与炎性反应，引起以代谢综合征、2型糖尿病为代表的胰岛素抵抗相关疾病的发生。
本实验以原代大鼠前体脂肪细胞为研究对象，观察新型格列酮类化合物ANY2对正常状态下脂肪细胞分化的影响及胰岛素抵抗状态下对细胞代谢活动的影响。
1 材料与方法
1.1 药品和试剂
DMEM培养基，GIBCO公司；HEPES，Merk公司；Ⅱ型胶原酶，胰蛋白酶(1∶250)，AMRESCO公司；游离脂肪酸(FFAs)测定试剂盒和考马斯亮蓝法总蛋白测定试剂盒，均由南京建成生物工程研究所提供；葡萄糖试剂盒，由上海科欣生物技术研究所提供；胰岛素注射液(江苏万邦生化医药股份有限公司，400单位，10mL，批号070603)； 匹格列酮，上海兰生股份有限公司提供；ANY2由中国药科大学药物化学教研室提供，纯度为98.5%。其余试剂均为市售分析纯。
吡格列酮和化合物ANY2均用二甲亚砜(DMSO)助溶，再用PBS稀释至终浓度1.1 mg·L-1（DMSO终浓度＜0.01%）。
1.2 仪器和用具
精密电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；LS-1F型超净工作台(上海索谱仪器有限公司)；YCP-200型CO2细胞培养箱(上海易亮医疗器械有限公司)；倒置显微镜(Olympus公司)；全波长酶联免疫检测仪(Thermo Election Corporation)。
1.3 实验动物
清洁级SD大鼠，雄性，体重250～300g，由河南省郑州大学动物实验中心提供，SCXK(豫)2005-0001。
1.4 实验方法
1.4.1 原代前体脂肪细胞的提取［1］
SD大鼠1只，雄性，体重（250±30）g，脱颈椎处死，75％(v/v)乙醇浸泡约1min后在超净台无菌条件下打开腹腔，用眼科剪剪下二侧附睾脂肪垫(注意避开血管和附睾)。冰无菌生理盐水洗涤脂肪垫3次，眼科剪剪碎成约0.5mm×0.5mm×0.5mm～1mm×1mm×1mm大小均匀的小颗粒，以1000r·min-1离心5min，取上层的纯脂肪颗粒于50mL圆底聚丙烯塑料管内，加入2倍于脂肪组织块体积1mg·mL-1的Ⅱ型胶原酶溶液进行消化，置37℃ 5% CO2 条件下孵育，每5min震摇1次，直至脂肪组织块呈絮状，约需40min，取出塑料管，消化液过150目不锈钢筛网，并不断用滴管吹打以利于细胞过筛，过筛后的细胞悬液收集于15mL塑料离心管，以1000r·min-1离心5min，弃去上层脂肪层和液体，细胞沉淀用PBS缓冲液清洗，1000r·min-1离心5min，重复1次；细胞沉淀悬浮于含5%小牛血清的H-DMEM培养基中，置37℃ 5% CO2 条件下培养。
1.4.2 原代前体脂肪细胞的接种
将细胞接种于培养瓶中，加入原代培养基(H-DMEM培养基中另含有100U·mL-1青霉素加100U·mL-1链霉素)，在37℃孵箱(5%CO2加95%空气)中培养细胞，每2天换液1次，待细胞生长至接近完全融合时(设定为第1天)开始传代并诱导分化。
1.4.3 脂肪细胞鉴定［1］
油红O染色 移去细胞培养基，用PBS洗细胞2次，每孔加10%福尔马林溶液，置室温条件下固定40min后，PBS洗3次，每孔加入200μL油红O溶液浸染30min；PBS洗2次，显微镜下观察，脂肪细胞中脂滴被染成红色，图1(见封4)。
1.4.4 最佳分化条件的选择
将消化后的细胞以5×105个·mL-1均匀地接种于24孔细胞培养中，待细胞生长贴壁后，加入转化培养基培养(H-DMEM培养基中含不同浓度的胰岛素和地塞米松，见表1)，96h后，撤去胰岛素和地塞米松，每2天换培养液1次，至细胞融合，同时设立基础培养基对照组。油红O染色后，异丙醇萃取，萃取液于510nm测定吸光度值，确定最佳细胞分化条件，即诱导培养基；在后续的实验中，以诱导培养基培养的细胞组为诱导组。
1.4.5 地塞米松诱导胰岛素抵抗及其检测［2］
诱导分化的细胞中加入1μmol的地塞米松，此为模型组(同时设立无地塞米松对照组)，持续作用4d，每2d换液1次，取培养上清，GOD-POD法的微量化测定法检测培养上清中的葡萄糖含量，以培养基中的葡萄糖的消耗量反映胰岛素抵抗（IR）的程度。
1.4.6 新型格列酮类化合物ANY2对原代前体脂肪细胞分化的影响
取未分化的脂肪细胞以1×105个·mL-1接种于24孔培养板中，分为对照组、诱导组、匹格列酮组和ANY2组，每组4孔。细胞贴壁后，除对照组外，其他3组加入诱导培养基和相应的药物，作用4d。撤去诱导培养基和药物继续培养至细胞融合，弃去培养液→PBS洗2次→10%福尔马林室温条件下固定30min→PBS洗3次→每孔200μL油红O浸染细胞，室温放置20min→PBS洗2次→每孔加300μL异丙醇萃取，室温放置20min，100μL转移于洁净96孔培养板，510nm测定吸光度值，确定细胞分化情况。
1.4.7 新型格列酮类化合物ANY2对原代IR脂肪细胞代谢作用的影响
取未分化的脂肪细胞以1×105个·mL-1接种于24孔培养板中，分为对照组、诱导组、模型组、匹格列酮组和ANY2组，每组4孔。细胞贴壁后，除对照组外，其他4组加入诱导培养基作用4d；撤去诱导培养基继续培养至细胞约80%融合；模型组、匹格列酮组和ANY2组均加入1μmol·L-1的地塞米松，每2天换液1次，作用4d，复制IR细胞模型；各组细胞均换入基础培养基，并且匹格列酮组和ANY2组分别加入相应药物，作用2d。培养结束后，取各组细胞培养上清检测葡萄糖的消耗量和FFAs溢出量。
1.5 统计学方法
实验数据均以均数±标准差(±s)表示，以t检验分析组间差异，P＜0.05为差异有显著统计学意义，P＜0.01为差异有非常显著统计学意义。
2 结果
2.1 脂肪细胞鉴定
显微镜下观察，原代脂肪细胞为梭型或三角形，经过诱导，细胞分化充脂，细胞内有脂滴形成，经油红O染色后，脂滴被染成红色(图1，见封4)。
2.2 前体脂肪细胞最佳分化条件
脂肪细胞经油红O染色后，异丙醇萃取，510nm处读取OD值；各组OD值与对照组OD值的比值为分化比例，比较不同浓度胰岛素和地塞米松对前体脂肪细胞分化作用的影响。
结果可见，不同浓度胰岛素和地塞米松均可以引起大鼠前体脂肪细胞分化，但分化程度有所不同。当胰岛素浓度为5×10-8mol·L-1，地塞米松浓度为0.01μmol·L-1时，前体脂肪细胞分化程度最高，由此条件培养的细胞为诱导组(以下实验均以此条件进行)，见表1。表1 不同浓度胰岛素和地塞米松对前脂肪细胞分化的作用(略)
2.3 新型格列酮类化合物ANY2对前体脂肪细胞分化的影响作用
脂肪细胞经油红O染色后，异丙醇萃取，510nm处读取OD值；各组OD值与诱导组OD值的比值为分化率，比较匹格列酮和ANY2对前体脂肪细胞分化作用的影响。
结果表明，匹格列酮和ANY2均可促进大鼠原代前体脂肪细胞分化充脂，并增加小脂肪细胞数量；与诱导组比较，差异有显著统计学意义(P＜0.05)，见表2。表2 化合物ANY2对前体脂肪细胞分化的影响作用(略)
2.4 新型格列酮类化合物ANY2对原代IR脂肪细胞FFAs溢出及糖耗量的影响
以葡萄糖氧化酶法测定细胞培养上清液中葡萄糖含量，以无细胞对照组培养液中葡萄糖含量减去各组细胞培养液中葡萄糖含量，即为细胞所消耗的葡萄糖量(GC)；以铜试剂法测定FFAs含量，考马斯亮蓝法测定细胞裂解液蛋白含量，比较各组GC和FFAs溢出量。
结果表明，ANY2可显著增加IR脂肪细胞糖耗量，减少FFAs溢出，与模型组比较差异有统计学意义，见表3。表3 化合物ANY2对IR脂肪细胞FFAs溢出及糖耗量的影响(略)
3 讨论
前体脂肪细胞是一类具有增殖和向脂肪细胞分化能力的细胞，它持续存在和作用于动物的一生［3］。前体脂肪细胞的原代培养能保持细胞的生物学特性，便于直接观察各种因素对细胞分化过程的调控机制，是研究脂肪组织的理想模型，也是与脂肪代谢有关的疾病发病机制研究以及相关药物筛选与作用机制研究的重要细胞模型［4］。已建立的来源于鼠前脂肪细胞的细胞株如3T3-L1系列等，在国外应用广泛，但对国内来说，存在着标准细胞株难以得到的问题，而且细胞经过传代后其性状、生物学特性会有一定的改变，与在体实验的联系受到限制。我们对Yu等［5］的方法进行了改良，使用低浓度胰岛素和地塞米松诱导和降低培养液中血清含量等，以此促使细胞自然向脂肪细胞分化，从而建立了大鼠前脂肪细胞的原代培养方法。培养细胞的形态学观察显示，脂肪细胞贴壁后初为类圆形，3d后即可观察到细胞渐成梭形，7d左右细胞增殖明显，形状由多角梭形变为椭圆形，并开始积聚脂肪颗粒。
脂肪细胞的重要功能是储存脂肪；胰岛素抵抗时脂肪细胞即表现为储存脂质能力的下降，甘油三酯分解加快，FFAs过度溢出；而高浓度的FFAs又可引起和加重胰岛素抵抗。两者互为因果，相互影响［6］。
通过结果可以看出，化合物ANY2可显著促进前体脂肪细胞分化，提高细胞储脂能力；1μmol·L-1地塞米松作用于大鼠原代脂肪细胞，可明显减少细胞对培养基中葡萄糖的摄取，FFAs溢出量也大大增加，说明细胞胰岛素抗性已基本形成。化合物ANY2可显著增加细胞糖耗量，减少其因脂解作用释放到上清中FFAs的浓度，同时还增加对胰岛素敏感的小脂肪细胞数目，改善胰岛素抵抗状态，其作用与匹格列酮相当，具有良好的开发潜力。
参考文献
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