作者：才春东， 姜宁，王国增，郑景存
【摘要】 目的 探讨枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石骨桥蛋白（osteopontn，OPN）表达的影响。方法 32只8周龄雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组、枸橼酸钾组、结石组(乙二醇和氯化氨)、结石+枸橼酸钾组，每组8只，采用乙二醇和氯化铵诱导大鼠肾草酸钙结石模型进行试验研究。连续给药4周后处死大鼠取肾组织，采用HE染色和免疫组化法检测各组肾结石形成及OPN表达情况。结果 结石+枸橼酸钾组大鼠肾结石形成比结石组明显减少(P＜0.05)；结石+枸橼酸钾组大鼠的OPN表达比结石组明显降低(P＜0.05)；枸橼酸钾组OPN表达与对照组相比无明显变化( P＞0.05)。结论 枸橼酸钾可能通过减少草酸钙结晶的形成而减轻对肾小管上皮细胞的损伤，降低肾OPN的表达。
【关键词】 枸橼酸钾；骨桥蛋白；肾结石
Abstract: Objective To examine the effect of citrate on osteopontin(OPN) expression of urinary oxalate calcium (CaOx) stone formation in rats.Methods thirty-two adult male wistar strain rats were randomly pided into four groups (n=8 each): normal control group、the citrate group、stone formation group（ethylene glycol(EG)and ammonium chloride）and the stone formation-citrate group.After 4 weeks medication，the rats were killed and kedney was used for histological examination.The formation of renal stone and the expression of OPN in rat renal tissue of each group were determined with HE staining and Immunohistochemistry methods.Results The formation of renal stone in the stone formation-citrate group was significantly lower than that in the stone group.The expression of OPN in the stone formation-citrate group was significantly less than that in the stone group.However those in the contol group and in cirate group showed the same.Conclusion Citrate can reduce crystal formation and crystal damaging on renal duct and decrease OPN expression.
Key words:citrate; OPN; CaOx stone
泌尿系结石是泌尿外科常见的疾病。虽然泌尿系结石的治疗技术不断提高，治疗策略不断完善，但其复发率却无明显降低［1］。既往研究表明，枸橼酸钾对结石的预防起重要的作用，尤其对草酸钙结石的发生或形成具有抑制作用［2］。目前，枸橼酸钾对骨桥蛋白（osteopontn，OPN）表达的影响尚不完全清楚。本文通过枸橼酸钾对OPN表达的研究，希望能够为预防结石的产生提供新的依据。
1 材料和方法
1.1 材料
8周龄健康雄性Wistar大鼠32只，体重180～220g，由上海第二军医大学动物实验中心提供。乙二醇、枸橼酸钾和氯化氨购于上海长城华美仪器化剂公司。兔抗OPN的多克隆抗体购于北京博奥森生物科技有限公司，二步法免疫组化试剂盒购于上海长岛生物科技有限公司。
1.2 动物处理
以1%乙二醇和1%氯化氨混合溶液为致石剂。大鼠饲养1周，充分适应环境后，随机分成4组，每组8只。正常对照组以纯净水2mL灌胃，枸椽酸钾组以25%枸椽酸钾溶液1mL·100g-1灌胃，结石组以致石剂2mL灌胃，结石+枸椽酸钾组以致石剂2mL灌胃同时用25%枸椽酸钾溶液1mL· 100g-1灌胃。各组动物每日灌胃1次，连续4周。实验结束后，取左侧肾脏，用10%甲醛固定，在肾脏中段横取2mm厚的组织块，进行梯度乙醇脱水、用二甲苯透明、浸蜡、包埋，Leitz1512切片机作连续切片4张，厚度为5μm。
1.3 常规HE染色
切片以二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化。入苏木素染液5min，1%盐酸乙醇溶液分化5s，自来水蓝化30min，1%伊红染液1min，各级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。
1.4 免疫组化
对大鼠肾组织的石蜡切片，厚度5μm，行免疫组化染色：① 切片以二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，3%h3O2室温孵育消除内源性过氧化物酶的活性；② 磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，0.01mol·L-1柠檬酸缓冲液做抗原修复；③ 滴加兔抗OPN多克隆抗体（1∶200稀释，每次实验均设2张阴性对照，以PBS代替一抗)，4℃过夜；④ PBS冲洗，滴加二抗，室温30min；⑤ PBS冲冼，DAB显色，苏木素复染，脱水，中性树胶封片。
1.5 显微镜观察
用Olympus光学显微镜(×400)观察各组别的常规HE切片及免疫组化切片。HE切片 “-”表示无结石及结晶沉淀物;“+”表示少量结晶沉淀物;“++”表示有结晶沉淀物，有时可见游离结石形成;“+++”表示有大量的结晶，并有游离结石形成。免疫组化切片按“+”表示肾小管胞浆轻度染色(浅黄色);“++”表示肾小管胞浆中度染色(黄色);“+++”表示肾小管胞浆明显染色(深棕黄色)。随机选取5个视野进行分级并统计分析。
1.6 统计学方法
数据采用SPSS 13.0统计软件，采用Kruskal-Walls非参数检验对4组大鼠肾脏成石程度和OPN表达强度进行统计分析，采用Mann-whitney非参数检验进行组间两两比较。
2 结果
2.1 大鼠肾脏病理切片中草酸钙晶体形成情况
草酸钙结晶在常规病理切片为无色透明晶体。本实验中对照组和枸橼酸钾组大鼠肾小管未见扩张和草酸钙晶体沉积（如图1A、B，见封2）；结石组大鼠部分肾组织肿胀，表面点状分布黄白色结晶或钙化，镜下见多数管腔内存在弥漫散布无色透明，大多呈连续片状结晶，皮质多于髓质，结晶体主要位于近曲小管和远曲小管，上皮细胞明显肿胀、变性、坏死，管腔内可见嗜伊红样染色坏死物质及部分脱落上皮细胞，且肾间质有炎性细胞浸润（如图1C，见封2）；枸橼酸钾+结石组肾小管腔仅见较少散在草酸钙结晶存在，管腔扩张程度较轻（如图1D，见封2）。大鼠肾脏成石程度分级结果详见表1。表1 各组大鼠肾脏成石程度分级（略）
2.2 免疫组化结果
OPN在所有4组中均有表达，在肾近曲小管和远曲小管、亨利氏袢和集合管(主要髓袢升支)均明显表达，而在皮质肾小球中则未见表达。对照组OPN微弱表达（图2A，见封2）；枸橼酸钾组OPN呈微弱表达（图2B，见封2）；结石组大鼠肾组织中OPN表达增强（图2C，见封2）；结石+枸橼酸钾组肾组织OPN的表达（图2D，见封2）强于对照组，较结石组弱。大鼠肾脏骨桥蛋白程度分级结果详见表2。表2 各组大鼠肾脏骨桥蛋白程度分级（略）
2.3 肾脏成石程度与OPN表达程度的关系
在成石强度为“+++”的结石组大鼠肾组织中OPN表达明显增强为“+++”;而对照组和枸橼酸钾组大鼠OPN表达则均呈弱阳性“+”。将每只大鼠的成石程度与OPN表达强度相对应，可以发现肾脏内结石形成越明显，肾组织OPN表达越强，反之肾脏内结石形成越少，则肾组织内OPN表达越弱。
宁夏医科大学学报32卷3 讨论
结石患者尿中钙和草酸盐经常处于过饱和状态，它们是肾结石形成的主要原因之一。正常人之所以不形成结石，是尿中存在着足够的结石形成抑制物，主要包括OPN、TammHorsfall蛋白、肾钙素、尿凝血酶原片段1等。
OPN为一带负电荷的多功能磷酸化糖蛋白，可由全身多个组织和器官分泌。肾脏OPN主要由亨利氏襻、近曲小管和肾乳头表面上皮分泌，与草酸钙结晶具有强亲和力，能够抑制尿液中草酸钙结晶体的成核、生长和聚集，是一种草酸钙结晶的强抑制物［3］。正常情况下OPN不与存在于肾小管上皮细胞的基底膜面的αvβ3整合素［4］结合，当上皮细胞损伤，例如由高草酸尿、高钙尿诱发的损伤，可扰乱细胞极性，使整合素取向到小管腔内表面与草酸钙结晶黏附的OPN结合，形成结石的生成位点，促使草酸钙晶体成核、生长、聚集，生成结石［5］。
枸椽酸是结石抑制因子之一［2］，在正常情况下，口服枸橼酸钾，大约80%被体内吸收氧化，保留钾离子而产生碱负荷：一方面提高尿pH值而使尿枸橼酸排泄增加，另一方面慢性钾离子存留可使尿钙降低［6-7］；约20%未在人体中氧化，直接代谢进入尿液中的枸橼酸对尿中草酸钙结晶和磷酸钙结晶形成较强的抑制作用，对于防治钙性结石具有重要意义［8］。
本实验中，对照组和枸椽酸钾组大鼠OPN表达呈弱阳性；结石枸椽酸钾组大鼠仅1只OPN表达呈弱阳性，另外7只 呈不同程度的增强；结石组OPN表达均高于对照组。并显示大鼠的成石程度与OPN表达强度相一致，即肾组织内结石形成越明显，OPN表达越强；而肾组织内结石形成越少，OPN表达越弱。OPN的过高表达是由大鼠用乙二醇和氯化铵灌胃后诱导产生高草酸尿、高钙尿和草酸钙晶体在肾脏的沉积共同调控所致。YASUI等研究表明，用乙二醇和α1，25-(OH)2-VitD3灌胃而形成的草酸钙肾结石大鼠模型中，肾小管细胞中OPNmRNA表达明显增强［9］。本实验从蛋白水平证明用乙二醇和氯化氨灌胃而形成的草酸钙肾结石大鼠模型中，肾小管细胞中OPN的表达明显增强。OPN的这种分泌情况，是机体的一种防御机制。枸橼酸钾能抑制草酸钙结晶的形成，降低草酸钙结晶对肾小管的损害，对肾小管有保护作用。居正华等发现，枸橼酸钾可使尿枸橼酸及TammHorsfall蛋白增高，并减少草酸钙结晶的聚集，减低结石的形成［10］。
本研究的结果表明，枸橼酸钾可能通过减少草酸钙结晶的形成和结晶对肾小管上皮细胞的损伤，降低肾OPN的表达，并减少OPN黏附于受损的上皮细胞表面的成核位点，使草酸钙晶体在肾脏的沉积减少，从而减少大鼠肾结石形成。枸橼酸钾影响OPN表达的具体机制还有待进一步研究。
参考文献
［1］Moe OW.Kidney stones:pathophysiology and medical management［J］. Lancet，2006，367: 333-344.
［2］Pak CYC.Medieal management of the Phro1ithiasis in Dallas［J］. J Uro，1988，140: 461-467.
［3］常连胜，冯陶，郭应禄，等. 结石病人尿骨桥蛋白测定的临床意义［J］. 中华泌尿外科杂志，2000，21(12): 709-711.
［4］Hoyer JR，Otvos L，JR，et al. Osteopontin stone formation［J］. Ann N YAcad Sci，1995，760: 257-265.
［5］Riese RJ，Mandel NS，Wiessner JH，et al. Cell polarity and calcium oxalate crystal adherence to cultured collecting duct cells［J］. Am J Physiol，1992，262: 177-184.
［6］Macdonald HM，New SA，Fraser WD，et al. Low dietary potassium intakes and high dietary estimates of net endogenous acid production are associated with low bone mineral density in premenopausal women and increased markers of bone resorp tion in postmenopausal women［J］. Am J Clin Nutr，2005，81(4): 923-933.
［7］Maurer M，RiesenW，Muser J，et al. Neutralization of Western diet inhibits bone resorp tion independently of K intake and reduces cortisol secretion in humans［J］. Am J Physiol Renal Physiol，2003，284(1):32-40.
［8］Zerwekh JE，Reed-Gitomer BY，Pak CY. Pathogenesis of hypocitraturic nephrolithiasis［J］. Endocrinol Metab Clin N Am，2002，3(4): 869-884.
［9］米其武，曹正国，刘继红，等. 泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响［J］. 中草药，2005，36(12): 1827-1831.
［10］居正华，张旭，王小刚，等. TH蛋白和枸橼酸对尿草酸钙结晶动力学的影响的研究［J］. 中国现代医学杂志，2005，15(10): 1496-1499.