作者：韩宇， 宋玉， 乔光伟， 景捷
【摘要】 目的 研究舌鳞癌联结细胞与细胞外基质的关键结构β-DG的变异情况。方法 免疫组化SP法，用NCL-b-DG Beta-Dystroglycan 鼠单克隆抗体43DAG1/3D5，以正常舌黏膜为对照，研究正常β-DG所在部位，以及舌鳞癌中β-DG的变异特点。结果 正常舌黏膜上皮β-DG主要位于其上皮的基底层，以基底膜处最为集中;舌鳞癌组织的癌巢周围及癌细胞膜处β-DG缺失。结论 在舌鳞癌中，联接细胞骨架和细胞外基质的结构从β-DG处断裂。细胞内和细胞外联接的断裂，可能会使癌细胞生长的自限性丧失，从而导致癌细胞获得侵袭与转移的能力。
【关键词】 舌;鳞状细胞癌;β-肌营养不良蛋白聚糖;免疫组织化学
肌营养不良蛋白聚糖(Dystroglycan，DG)是联结细胞内细胞骨架与细胞外基质的重要结构，它由2个亚单位组成：β-DG 位于细胞膜表面与细胞外基质相连;β-DG为跨膜蛋白与细胞骨架相结合。DG对维持组织的正常结构和正常功能起着关键性作用[1]。研究表明人类某些恶性肿瘤中的β-DG表达异常[2]，而这种异常的可能对恶性肿瘤的侵袭与转移起着重要的作用。舌鳞癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，因易复发、易出现区域淋巴结转移，使舌鳞癌的预后较差。从复发转移的基本过程来看，由于原发部位的肿瘤细胞脱离原发瘤，侵袭穿越基底膜并向周围间质浸润生长，是导致肿瘤复发和转移的始动环节，如果舌鳞癌存在异常的DG，说明舌鳞癌的癌细胞与周围组织的连结也可能出现分离，这可能正是舌鳞癌出现转移与复发的分子生物学基础。通过研究舌鳞癌癌细胞的细胞骨架与细胞外基质联结体的关键结构DG的异常变化，能明确肿瘤细胞是否在这一联结体上出现了异常，为探索舌鳞癌癌侵袭和转移机制开辟一条新的途径，也为进一步的相关研究提出理论基础。
1 材料和方法
1.1 主要实验试剂
NCL-b-DG Beta-Dystroglycan mouse monoclonal antibody 43DAG1/3D5：Novocastra Laboratories，UK;ZLI—9032/9033 DAB Kit/DAB浓缩型DAB试剂盒：北京中彬金桥生物技术有限公司;SP9002(生物素标记山羊抗小鼠IgG)HistostainTM—Plus Kits免疫组化染色试剂盒：北京中彬金桥生物技术有限公司;牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)：Santa Cruz(US);辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的链霉素亲和素复合物：Santa Cruz(US);浓缩型DAB试剂盒(ZLI-9032，DAB Kit/DAB)：北京中杉金桥技术有限公司;4%多聚甲醛溶液：将4g多聚甲醛(Paraformaldehyde、SIGMA公司)加入到100mL PBS中，60℃恒温箱内加热溶解30min。
1.2 新鲜组织标本和舌鳞癌细胞株处理
选择2009年1月至2009年7月在宁夏医科大学附属医院口腔颌面外科住院治疗的舌鳞癌病例11例，术前未经任何治疗，所有病例均经病理证实，所有患者均行手术治疗。男8例，女3例，年龄37～65岁，平均51岁。病史2至6个月，平均3个月;原发部位左侧4例，右侧7例;高分化者5例，中低分化者6例。对照的正常舌黏膜取自1例舌血管畸形手术标本，选择病灶边缘外1cm处含有的正常舌黏膜、黏膜下层及舌肌的组织块。术中切取新鲜组织标本约1cm×1cm×0.3cm大小，立即置于液氮中保存备用。制备冰冻切片过程中，使切片机和切片刀的温度维持在-20℃左右，切片厚度10μm。切片完成后，标本置于-70℃冰箱保存备用。
舌鳞癌Tca8113细胞株由四川大学生命科学院提供。将冻存的人口腔鳞癌Tca8113和BcaCD885细胞株从液氮罐内取出，直接投入37℃温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融化后，取出冻存管。用洒精消毒后开启，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍RMPI-1640细胞培养液，混合后低速离心，除去上清液，再重复用RMPI-1640细胞培养液洗1次。用台盼蓝行活细胞计数，确定活细胞数大于95%后，用含10%小牛血清的RMPI-1640细胞培养液稀释成5×104个·mL-1细胞密度，再将其接种于10%小牛血清的RMPI-1640细胞培养液的含盖玻片的培养瓶中，在37℃，5%CO2条件下培养24h。
1.3 免疫组织化学β-DG 检测
将冰冻切片和细胞爬片置于冰面上，用4%多聚甲醛PBS溶液固定组织5min，以PBS液反复冲洗。再将切片浸入0.3%h3O2/甲醇液，室温浸泡30min，以灭活内源性酶，先以蒸馏水冲洗，再用PBS液洗片5min×3次。再滴加5%BSA封闭液，室温下作用20min，甩去多余液体，不洗。
实验组加一抗：以1∶200 浓度的NCL-b-DG(溶于PBS)孵育，4℃过夜。PBS洗涤切片5min×3次。
对照组不加一抗，以PBS液孵育，4℃过夜。PBS洗涤切片5min×3次。
加二抗：滴加工作浓度为1∶400的SP9002(生物素标记山羊抗小鼠IgG)，37℃ 30min，PBS洗5min×3次。
滴加工作浓度为1∶400的HRP标记的链霉素亲和素复合物于切片组织面，作用30min，PBS洗5min×4次。
DAB显色：使用DAB显色试剂盒，取1mL蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般5min，蒸馏水洗涤。再用苏木素轻度复染2min，脱水，透明，封片。
1.4 结果判定 阳性表达棕黄色，阴性细胞核为蓝色。结果判定：β-DG的免疫活性主要表现在细胞膜和基底膜上，显示为棕黄色颗粒，当出现β-DG表达的癌细胞占全部癌细胞数的10%或10%以上时，定为β-DG蛋白表达阳性;不足10%时，定为阴性[3]。
2 结果
2.1 正常舌黏膜上皮免疫组织化学β-DG特征
用NCL-b-DG 单克隆抗体43DAG1/3D5检测正常舌黏膜上皮，发现β-DG主要位于舌黏膜鳞状上皮的基底层，沿基底膜最集中。随着舌黏膜由基底层向角化层的过度，β-DG阳性染色的色泽逐渐变淡(图1-2，见插页4)。
2.2 舌鳞癌免疫组织化学β-DG特点
用NCL-b-DG 单克隆抗体43DAG1/3D5检测舌鳞癌，发现在11例舌鳞癌标本中，均出现异常β-DG表达，表现为癌细胞团块周围并没有类似于正常舌黏膜上皮基底层所存在的基底膜免疫特染区。高分化舌鳞状细胞癌的角化珠周围也未见类似黏膜上皮的基底膜样结构的免疫组化特染区;低分化舌鳞状细胞癌的癌细胞及肿瘤边缘亦未见β-DG免疫组化特异性染色区(图3-4，见插页4)。
舌鳞癌常侵及舌肌组织，用NCL-b-DG 单克隆抗体43DAG1/3D5免疫组化染色，显示舌肌被癌组织破坏，癌细胞团块侵蚀正常舌肌纤维，使舌肌纤维的正常结构消失;部分区域于癌细胞间可见少量细条索状舌肌肌膜样结构;癌细胞团块与舌肌组织间可见淋巴细胞浸润(图5-6，见插页4)。
2.3 舌鳞癌Tca8113细胞株免疫组织化学β-DG特点
用NCL-b-DG 单克隆抗体43DAG1/3D5检测舌鳞癌Tca8113细胞株，发现癌细胞并没有表达出β-DG的免疫特染区(图7-8，见插页4)。
3 讨论
目前临床上治疗舌鳞癌方式的选择和预后的评判主要依赖于临床病理指标，如原发灶部位、TNM分类、病理分级、切缘状况、肿瘤浸润深度、肿瘤累及周围骨组织和神经侵犯等[4-6]。但是，上述评判指标有时并不能够确切评测舌鳞癌的实际预后，这说明，判断舌鳞癌预后可能还需要结合其它指标。
本研究结果显示，在正常舌黏膜上皮组织中，β-DG主要位于舌黏膜鳞状上皮的基底层，以基底膜处的表达最为集中;向角化层方向有逐渐减弱的趋势。基底细胞层是单层的立方形细胞，通过基底膜与固有层结缔组织相连。由β-DG作为跨膜蛋白，与细胞外的膜表面蛋白β-DG结合后，将舌黏膜基底细胞与基底层相连，使细胞与细胞外基质联结，从而达到了维持舌黏膜正常形态及功能的目的。这种联结方式是正常口腔黏膜基底层细胞与基底膜联结方式之一。另外，在正常舌黏膜上皮细胞与细胞间也显示有β-DG蛋白表达，说明β-DG除了是联结细胞与细胞外基质的结构外，还是黏膜上皮细胞间联结结构。
在舌鳞癌中，癌巢周围相当于正常黏膜上皮基底膜处β-DG丧失;同时，癌细胞与癌细胞之间β-DG也存在着缺失现象。说明，在舌黏膜鳞癌中，细胞骨架与细胞外基质、细胞与细胞的联结体由于β-DG的缺失而导致了断裂。而细胞内和细胞外的联接、细胞与细胞间的联结一旦出现断裂，癌细胞生长的自限性就会丧失，从而导致癌细胞获得侵袭周围正常组织结构的能力。
对于发育和维持正常组织结构起着重要作用的这种细胞与细胞外基质之间的相互联结，也许与舌鳞癌的发展与预后有关。肿瘤细胞与其细胞外基质蛋白质之间联结体的异常，可能预示着癌细胞的生物学行为的异常，这种联结异常所造成的结构与功能的缺失可能会造成肿瘤细胞的转移。
黏附分子能连结表皮细胞至基底膜的层黏连蛋白，同时起着使细胞与细胞外环境交换信息，联结与调控细胞骨架，参与信号转导的作用[7]。当β-DG异常时，β-DG能通过整合素通路来影响细胞的黏附性。β-DG的异常不仅导致了联结细胞与细胞外基质联结体的结构，而且会导致细胞形态的变化和细胞黏附性的丧失，同时也可能影响信号通路。β-DG本身是通过与Grb-2的交联来达到细胞与细胞间的信号转导作用的[8]。因此，单纯β-DG丧失，导致的后果不只是造成舌鳞癌的细胞与细胞外基质联结丧失的问题。
由此，我们可以得出以下结论：(1)正常舌黏膜上皮β-DG主要位于其上皮的基底层，以基底膜处最为集中。(2)舌鳞癌癌组织β-DG丧失，说明，在舌鳞癌中，联接细胞骨架和细胞外基质的结构由于β-DG的缺失而导致了断裂。(3)细胞内和细胞外联接的断裂，会使癌细胞生长的自限性丧失，从而导致癌细胞获得侵袭周围正常组织结构的能力。
参考文献
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