关于cmyc反义寡核苷酸联合5Fu对胃癌的体外及裸鼠体内抗肿瘤作用

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　　　　　　　　作者：蔡辉　王晓鹏　苏河　李荣范　马云涛　李振军

【摘要】 　　目的： 探讨cmyc反义寡核苷酸(ASODN)联合5Fu对胃癌MKN45细胞株的体内、外抗肿瘤作用. 方法： 采用脂质体介导cmyc反义寡核苷酸转染人胃癌细胞系，用四甲基偶氮唑盐法(MTT法)评价cmyc ASODN联合5Fu对胃癌细胞增殖的影响；流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡率和细胞周期；RTPCR及免疫组化方法检测cmyc基因表达变化；建立荷瘤小鼠模型，通过皮下瘤体内注射药物观察肿瘤体积和抑瘤率的变化. 结果： cmyc反义寡核苷酸联合5Fu可显著抑制细胞增殖，细胞凋亡率（23.4±1.9）%，较单用cmyc反义寡核苷酸（10.6±1.1）%和5Fu（12.5±1.0）%的抑制作用更为显著（P&<0.01）；RTPCR及免疫组化显示ASODN和5Fu均使cmyc mRNA和蛋白表达下降；体内实验显示cmyc反义寡核苷酸联合5Fu可明显减少肿瘤体积，抑制肿瘤生长，抑瘤率达46.7%；较单一治疗组明显（P&<0.05）. 结论： cmyc基因反义寡核苷酸联合5Fu能明显抑制胃癌MKN45细胞增殖、诱导细胞凋亡和下调cmyc蛋白水平；且可有效抑制人胃癌裸鼠皮下肿瘤的生长.
【关键词】 基因，myc；5氟尿嘧啶；寡核苷酸类，反义；胃肿瘤；体外/体内
　　【Abstract】 AIM: To investigate the antitumor effect of cmyc antisense oligonucleotides combined with 5fluorouracil in vitro and in vivo. METHODS: The transfection of MKN45 cells with cmyc antisense oligodeoxynucleotide was mediated by liposome. Cell proliferation was obseved by MTT assay. The apoptotic rate and cell cycle were examined by flow cytometry(FCM). The expression of cmyc gene was detected by the method of immunohistochemistry and RTPCR at the mRNA and protein level respectively. Nude mice tumor models were conducted with transplanting human gastric cancer MKN 45 cells and tumor suppression rate and tumor volume were then evaluated. RESULTS: The apoptotic rate of the group by cmyc antisense oligonucleotides combined with 5fluorouracil reached (23.4±1.9)%， which was higher markedly than the rate of cmyc antisense oligonucleotides(10.6±1.1)% or 5fluorouracil(12.5±1.0)% seperately(P&<0.01). The tumor volume and the rate of tumor suppression of the combined group reached 46.7% in vivo experiment， which was significant compared to the separate group(P&<0.05). The results of immunohistochemical and RTPCR assays showed that cmyc antisense oligonucleotides and 5Fu could decrease the expression of cmyc gene. CONCLUSION: Cmyc antisense oligonucleotides combined with 5fluorouracil can inhibit cell proliferation， downregulate cmyc gene expression， induce the apoptosis of MKN45 cells and effectively suppress the growth rate of gastric cancer cells in subcutaneous tumor. It can provide a new option to treat the gastric carcinoma.
　　【Keywords】 genes， myc; 5fluorouracil; oligonucleotides， antisense; stomach neoplasms; in vitro/in vivo
　　0引言

　　原癌基因cmyc的蛋白产物是一种DNA结合的磷酸化蛋白质，是调节细胞生长分化的重要转录激活因子. cmyc基因不仅参与了胃癌的发生，而且在胃癌的发展中亦起重要作用［1］. 5氟尿嘧啶（5Fu）是胃癌化疗的首选药物之一. 国内外对胃癌基因治疗结合化疗的研究较少. 因此，我们研究脂质体介导cmyc ASODN联合5Fu对胃癌MKN45细胞增殖、凋亡、cmyc蛋白表达的影响以及荷瘤裸鼠瘤体生长的影响，为临床治疗胃癌提供一定的依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　人低分化胃腺癌MKN45细胞株（上海生物化学和细胞研究所）；脂质体转染试剂LipofectamineTM2000（美国Invitrogen公司）；MTT(美国BIB公司)，DMEM培养基（Gibco公司）；鼠抗人cmyc一抗、生物素化山羊抗鼠IgG（II抗），DAB显色试剂盒（福州迈新公司）；针对cmyc mRNA第二外显子起始码及其后4个密码子合成反义寡核苷酸（ASODN）、正义寡核苷酸（SODN），正义链序列为5′ATG CCC CTC AAC GTT3′， 反义链序列为5′AAC GTT GAG GGG CAT3′， 并对合成的寡核苷酸进行全硫代修饰以增加其稳定性（由上海生物工程公司合成）. C57BL/6雌性小鼠（上海西普尔必凯动物有限公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1细胞培养
　　将MKN45胃癌细胞加入含100 mL/L的小牛血清的DMEM培养基中制成细胞悬液，镜下计数；调节细胞至约1×109/L接种于30 mL培养瓶中，于37℃，50 mL/L CO2的培养箱中常规培养至80%聚集密度时选取处于对数生长期的细胞用于实验.
　　1.2.2脂质体介导cmyc ASODN转染MKN45细胞
　　1.2.2.1转染混合物的制备A液用无抗生素、无血清的DMEM将cmyc ASODN及对照正义序列SODN的浓度分别调整为16，8，4，2，1 μmol/L；B液：按Lipofectin∶DMEM=6∶100 μL的比例配成；按A液与B液比例为1∶3混合，室温下放置约40 min，使脂质体与寡核苷酸充分包裹. 寡核苷酸的终浓度为4，2，1，0.5和0.25 μmol/L.
　　1.2.2.2转染及分组
　　将不同浓度的转染混合物加入96孔培养板中，分6组，每组5个平行孔. ① 空白组： 以B液代替转染混合物作为对照；② 5Fu组： 调整 5Fu的终浓度为5，10，20，40 μmol/L；③ ASODN组： 调整ASODN 的终浓度为4，2，1，0.5，0.25 μmol/L转染细胞；④ SODN组： 以相同浓度SODN/Lip转染细胞作为对照；⑤ SODN+5Fu组： 取1 μmol/L SODN与10 μmol/L 5Fu联合作用于细胞；⑥ ASODN+5Fu组：取1 μmol/L ASODN与10 μmol/L 5Fu联合作用于细胞.
　　1.2.3MTT法检测
　　MKN45细胞增殖抑制率转染后各组继续于37℃，50 mL/L CO2的培养箱中培养24，48，72，96 h后终止培养，终止反应时加入1 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h中止，弃去转染混合物，2.5 g/L胰酶消化收集细胞，每孔再加入150 μL DMSO，震荡10 min. 在酶联免疫检测仪上测定各孔A490 nm值. 抑制率（%）=（1-A实验/A对照）×100%，以培养时间为横轴，生长抑制率为纵轴绘制生长抑制曲线.
　　1.2.4流式细胞仪检测
　　细胞凋亡和细胞周期取1 μmol/L ASODN与10 μmol/L 5Fu各组，在细胞转染后继续培养72 h后将细胞密度调整至1×1010/L，PBS洗涤细胞2次，4℃，700 mL/L 乙醇固定12 h，离心除去乙醇，PBS洗细胞1次，加入50 mg/L RNA酶溶液100 μL，37℃水浴15 min，调整细胞密度至加入等体积的100 mg/L的碘化丙啶100 μL染色，常温下避光30 min，在流式细胞仪上检测细胞周期及细胞亚二倍体百分率.
　　1.2.5RTPCR法检测
　　cmyc的mRNA表达取上述各组细胞，提取总RNA测定A260 nm/A280 nm≥1.8. 按一步法RTPCR扩增试剂盒说明书进行扩增. cmyc引物：上游： 5′GAT TCT CTG CTC TCC TCG AC3′， 下游：5′TCC AGA CTC TGA CCT TTT GC3′，扩增片段长度250 bp. 内参对照Gapdh引物：上游：5′CTG ACC TGC CGT CTA GAA A3′，下游： 5′GTG GTG TGA CTT AGA GGG G3′，扩增片段长度380 bp. PCR扩增条件：94℃ 30 s， 58℃ 30 s，72℃ 30 s，共30次循环，最后72℃延伸10 min. PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳，并于凝胶图像分析仪上进行分析并拍照.
　　1.2.6免疫组化ABC法检测
　　cmyc的蛋白表达常规细胞爬片处理72 h后取出玻片，PBS清洗，丙酮固定；加入鼠抗人cmyc一抗，4℃冰箱过夜；PBS清洗后滴加生物素化山羊抗鼠IgG（II抗），保温、漂洗后加入ABC复合物，漂洗后使用DAB显色，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明树胶封片，以正常鼠血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗和二抗，行替代对照和空白对照. 切片染色完成后于光学显微镜下进行观察，以细胞质或细胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性，随机选取5个高倍视野进行记数，每高倍视野记数100个细胞，共500个细胞，计算Cmyc阳性细胞比率.
　　1.2.7裸鼠皮下移植瘤模型的建立及实验治疗
　　将1×109/L细胞悬液0.2 mL接种至裸小鼠皮下，待肿瘤生长至适当大小（肿瘤无出血、坏死）时，取出瘤体剪成1 mm×1 mm×1 mm 左右碎块，用20号穿刺针接种到裸鼠右前肢腋下皮下，7 d后选择肿瘤生长良好、直径约1 cm左右的荷瘤小鼠30只为实验模型. 随机分为6组，每组5只，分别于瘤体内注射0.6 mL 上述转染分组液lipofectin(Lip)，SODN/Lip，ASODN/Lip，5Fu，5Fu+ SODN/Lip以及5Fu+ ASODN/Lip，每隔1 wk注射1次，共3次. 用游标卡尺每周定期测量肿瘤最长径(a)和最短径(b)，按公式V=π×a2b/6计算肿瘤体积，根据公式肿瘤抑制率(%)=1-(V对照组-V治疗组)/V对照组×100%，观察5 wk，绘制生长曲线.
　　统计学处理：采用SPSS 13.0统计软件，用 x±s表示，采用t检验和单因素方差分析. P&<0.05表示差别有统计学意义.
　　2结果
　　2.1各组对MKN45细胞增殖的影响
　　ASODN可抑制MKN45细胞的增殖，5Fu也能够抑制MKN45细胞增殖，当联合应用ASODN（1 μmol/L）和5Fu（10 μmol/L）时，两者表现出协同作用，各个时间点两药联合的抑制效果明显高于单用ASODN组(P&<0.01，图1)和5Fu组(P&<0.01).
　　2.2各组对细胞凋亡的影响
　　与对照组相比，ASODN组、5Fu组和联合组均能诱导胃癌细胞凋亡(P&<0.01)，ASODN和5Fu联合组ASODN组和5Fu组细胞凋亡差异显著，有统计学意义（P&<0.01）. 同时ASODN组G0/G1期细胞增多，5Fu组S期细胞增多，与对照组相比差异显著（P&<0.01，表1）.表1流式细胞仪检测MKN45细胞细胞周期和凋亡率变化(略)
　　2.3各组对cmyc 蛋白表达抑制的影响
　　细胞免疫组化结果显示，与对照组相比5Fu组、SODN+5Fu组蛋白表达下降（P&<0.05），ASODN组和联合用药组则更为显著（P&<0.01）；联合用药组较单独5Fu组和ASODN组虽有差异，但无统计学意义（P&>0.05，表2）.
　　2.4各组对cmyc mRNA表达抑制的影响
　　RTPCR检测cmyc mRNA水平显示ASODN组、5Fu组、ASODN+5Fu组、正义+5Fu组较对照组相比RTPCR扩增条带明显减弱（图2）. 通过计算机图像分析结果表明，与对照组相比，联合组、ASODN组和5Fu组差异均有统计学意义（P值分别&<0.01，0.05，0.05）. 两者的联合组的抑制作用虽较两者单用的抑制作用稍强，但与单用两组相比无统计学意义（表2）. 表2Cmyc基因在mRNA和蛋白表达水平的变化(略)

转贴于 　　2.5各组裸鼠皮下肿瘤生长情况
　　治疗前各组裸鼠肿瘤体积无差别，治疗后随不同治疗时间各组出现明显变化：Lip组和SODN治疗组肿瘤持续增长；ASODN和5Fu治疗组在注射后1 wk肿瘤生长开始缓慢，瘤体缩小，且随时间增长其生长抑制作用更加明显，肿瘤抑制率与Lip和SODN对照组比较有统计学意义（P＜0.05，表3).表3不同治疗时间各组抑瘤率比较（略）
　　3讨论
　　ASODN比其他药物设计方法更具有优越性，因为它能灵活地联合许多化学修饰，调节药学性质，而不影响疾病相关基因的相互作用［2］，可以针对一些新靶点分子设计一段ASODN来观察其抗肿瘤生长及转移的作用，还可将其与化疗药物联合应用，研究其增效减毒作用.
　　cmyc基因是myc基因家族的成员之一，属核内转录因子，定位于人第8号染色体q24.1， 其表达产物cmyc蛋白. 其转录调控对象大多与细胞的增殖、分化、凋亡相关，其过量表达可诱导肿瘤产生［3-4］；cmyc基因不但参与细胞的增殖分化和凋亡过程，而且与肿瘤的形成和演进有关，还可刺激细胞增生，并且与突变型P53一起在肿瘤发生中协同发挥作用［5］. 研究表明cmyc表达越强，胃癌的恶性程度可能越高，预后可能越差［1］；Chen等［6］研究发现AdAS cmyc对胃癌细胞具有显著的体内外生长抑制及凋亡诱导作用. 邓健蓓等［7］用人工合成的反义cmyc寡聚脱氧核苷酸观察cmyc对MGC803细胞的DNA合成有抑制作用.
　　
　　5Fu的主要作用机制之一是抑制胸苷酸合成酶(TS)的活性，干扰DNA的合成和修复. 5Fu在体内也可以转化氟尿苷三磷酸（FUTP），直接嵌入RNA，影响RNA的功能［8］. 由于5Fu对TS的抑制和RNA的干扰所致的基因毒性，在敏感细胞导致细胞凋亡. 我们采用脂质体介导不同浓度cmyc ASODN转染人低分化腺癌MKN45细胞后，细胞增殖受抑、凋亡，其作用随浓度升高而增高；联合ASODN和5Fu的抑制作用更为显著，说明两者对胃癌细胞作用可能具有协同性. cmyc表达受抑导致肿瘤细胞凋亡的机制可能还有以下其它几个方面：① cmyc是原癌基因之一，可抑制细胞分化，当其表达受到抑制之后，启动了细胞的正常分化机制［9］.② cmyc拮抗了其他一些未知基因突变所致的潜在凋亡作用，当其表达受到抑制之后，这些基因发挥致凋亡作用. ③ 由于cmyc可抑制肿瘤细胞对损伤DNA的识别功能，当其表达受到抑制之后，细胞恢复其对损伤DNA的识别功能，使含有畸变染色体的肿瘤细胞凋亡［10］.
　　
　　另外，cmyc基因是许多抗肿瘤药物作用的靶点之一［11］. 我们的结果显示ASODN作用于胃癌细胞，S期细胞数较对照组明显减少，而G0G1期细胞数增多，并且凋亡率较对照组明显增高；5Fu作用于胃癌细胞后S期细胞增多. 这说明反义cmyc抑制细胞从G1期进入S期从而抑制细胞增殖，5Fu能将胃癌细胞阻止于S期. 通过cmycm RNA和蛋白表达检测发现，5Fu对cmyc的表达有抑制作用，这也可能与5Fu对胃癌细胞的增殖抑制有一定关系. 这些都可能解释cmyc ASODN和5Fu存在协同作用的机制.

参考文献

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