关于JAK激酶抑制剂AG490联合顺铂对喉癌细胞STAT3信号转导通路的抑制作用

作者：王俊阁 李晓明 路秀英

【摘要】 目的: 探讨Stat3信号转导通路在药物治疗喉癌中的作用机制. 方法：应用JAK激酶抑制剂AG490与顺铂(DDP)处理喉癌细胞系Hep2细胞，Western Blot检测Stat3信号转导通路成员表达，MTT法检测细胞增殖状态，流式细胞技术检测细胞周期与凋亡. 结果: AG490与DDP可以抑制喉癌细胞增殖，促进喉癌细胞凋亡（P=0.008），联合应用AG490与DDP可以起协同作用，喉癌细胞Stat3信号转导通路成员表达与活性明显下降. 结论: JAK激酶抑制剂AG490与DDP联合应用可能为治疗喉癌提供了新的理论基础.
【关键词】 喉癌 增殖 凋亡
　　0 引言
　　细胞因子的信号传导途径之一JAK酪氨酸蛋白激酶(Januskinase， JAK)信号转导子和转录活化子(signal transducers and activators of transcription， Stat)途径是近来研究的热点. 为了研究Jak/Stat3的活化与喉癌之间的关系，我们应用JAK激酶抑制剂AG490与顺铂（diamminedichloroplatinum，DDP）处理喉癌细胞，观察对Stat3通路以及喉癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨Stat3信号转导通路在药物治疗喉癌中的作用.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料 喉癌细胞系Hep2（美国国家癌症研究所病理实验室）培养在含有100 mL/L小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的RPMI 1640培养基(美国Gibcobrl公司)中，于37℃， 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养，实验所用的细胞均处于指数生长期. JAK激酶抑制剂AG490(美国Calbiochem公司)，DDP， RPMI 1640液配制药物溶液，根据量效曲线选定药物浓度.
　　1.2 方法 研究分组：① 对照组；② AG490组；③ AG490 + DDP组；④ DDP组. 溶液中含等量乙醇和DMSO.
　　1.2.1 AG490对细胞生长抑制作用的检测 接种细胞于96孔板，每孔接种100 μL含1×104个细胞，贴壁后，无血清培养细胞16～24 h，使细胞同步化. 空白对照组加无血清培养基，试验组分别加入AG490至终浓度为30 mg/L，DDP的终浓度4 mg/L， AG490+DDP组加药顺序为先加AG490，于6 h后加DDP，每组设6个重复孔. 分别培养至规定时间后，每孔含150 μL培养液，0，24，48，72 h分别加入5 g/L MTT 100 μL（美国Sigma公司），继续培养4 h，每孔加入5 g/L甲臜200 μL，弃去培养液，每孔加入150 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪测定A570 nm，重复实验3次，绘制生长曲线.
　　1.2.2 AG490处理后Hep2细胞细胞周期和凋亡率 无血清培养细胞16～24 h，使同步化，试验组分别加入AG490，至终浓度为30 mg/L，DDP的终浓度为4 mg/L，继续培养，0，24，48，72 h分别消化细胞，0.01 mol/L PBS 0.5 mL重悬细胞，冰乙醇固定细胞过夜，加入RNAase A至终浓度50 mg/L，37℃恒温水浴1 h，加入碘化丙啶（Propidium Iodide， PI）（美国Sigma公司）至质量浓度50 mg/L，4℃避光染色1 h，流式细胞仪EpicsXLⅡ型（美国Becton Coulter公司）检测， 实验重复3次，资料用Multicycle AV细胞周期分析软件处理. 同步化处理及单细胞悬液制备同前，应用凋亡检测试剂盒，0.01 mol/L PBS离心洗涤2次，200 μL结合缓冲液重悬，加入溴乙啶至终浓度1 mg/L，加入PI至2.5 mg/L，室温避光染色15 min，流式细胞仪检测.
　　1.2.3 Stat3蛋白及其靶基因产物表达和磷酸化活化的检测 无血清培养细胞16～24 h，使细胞同步化. 空白对照组加无血清培养基，试验组分别加入AG490至30 mg/L，DDP 4 mg/L；分别用胰酶消化收集对照组、AG490组、AG490 + DDP组、 DDP组. 参照美国Pierce公司蛋白提取方法，分别抽提胞质、胞核蛋白，用考马斯亮蓝G250试剂盒测定蛋白浓度. 取总蛋白100 μg经100 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后电转移到PVDF膜上，封闭后，加入Stat3， pStat3，BclxL与CyclinD1小鼠mAb（美国Santa Cruz公司，抗体稀释度为1∶70），加入二抗体HRP标记的山羊抗鼠IgG（抗体稀释度为1∶1000），βactin作为内参照，用ELC发光试剂盒（美国Amersham公司）检测杂交信号. 用GelPro凝胶分析软件进行半定量分析. 用表面密度代表条带的面积乘荧光强度，来表示目的蛋白的相对含量.
　　统计学方法：数据用x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行分析，组间比较采用方差分析及两两比较法进行.
　　2 结果
　　2.1 Hep2细胞增殖活力 Stat3在喉癌细胞系Hep2细胞中持续表达和磷酸化（图1）. 对照组没有抑制肿瘤细胞的增殖作用，AG490转染后12 h开始表现出一定的增殖抑制效应，36 h表现出明显的抑制效应，细胞活力持续下降(F=5.26， P=0.004)；DDP组表现出一定的增殖抑制效应；AG490与DDP作用于Hep2细胞后，细胞增殖水平下降. AG490+DDP组与DDP组相比差异有统计学意义（F=4.856， P=0.008， 图2）.
　　2.2 Hep2细胞周期和凋亡 AG490与DDP作用于喉癌细胞系Hep2细胞72 h后，G1期细胞比率由55.5%上升至70.7%，S期细胞比率分别由33.1%下降至25.7%，细胞增殖受抑制. AG49+DDP组70.7%的细胞阻滞于G0/G1期，高于AG490， DDP， 对照组(图3， P&<0.05). AG490与DDP共同作用于Hep2细胞72 h后，凋亡细胞百分比分别由2.3%增加至31.3%. AG490+DDP组、DDP组、AG490组、对照组凋亡率分别为31.3%， 23.5%， 14.1%， 5.1%；统计结果表明，AG490与DDP作用Hep2细胞后凋亡细胞增多，AG490+DDP组与对照组相比，差异有统计学意义（F=4.824， P=0.005).
　　2.3 Stat3信号转导通路成员活性与表达 AG490与DDP作用于喉癌细胞系Hep2细胞72 h后， Stat3蛋白表达与活性下调，其靶基因产物BclxL与CyclinD1表达下降(图4). 　　3 讨论
　　AG490是一个人工合成的苯亚甲基的丙二腈的脂类衍生物，其结构类似于酪氨酸，通过和受体酪氨酸激酶竞争结合位点，可以阻断Jak2和Jak3的激活，从而阻断Janus酪氨酸激酶信号转导和转录活化因子(Jak/Stat)信号传导［1］. JAKs/Stats信号转导通路与细胞的增殖、分化及凋亡关系密切，该通路异常活化可导致细胞异常增殖和恶性转化，Stats家族重要成员Stat3在多种肿瘤组织与细胞系中异常激活并且与肿瘤对治疗的反应密切相关，目前被确认为是癌基因［2］. 我们就Stat3信号转导通路在喉癌发生发展中的调控机制进行了初步研究，结果显示，Stat3在人喉癌组织与细胞系中异常活化，且与喉癌组织学类型、临床分期等密切相关［3］.
　　我们发现，Stat3通路在喉癌细胞系Hep2细胞增殖过程中持续激活，应用JAKs特异性抑制剂AG490作用于喉癌细胞系Hep2细胞，Stat3蛋白的表达量下降，磷酸化水平也降低，阻断Stat3活化可以诱导喉癌细胞凋亡，BclxL与cyclinD1蛋白表达同步下调. 说明AG490能够有效抑制Hep2细胞中Stat3蛋白的表达和活化. AG490作用于Hep2细胞后，细胞增殖受到明显抑制. Hep2细胞增殖水平随AG490作用时间延长而下降，相应空白对照组变化不明显. 因此AG490能够有效地降低Hep2细胞中Stat3蛋白的表达和活化水平，进而抑制细胞的增殖，促进其凋亡，其机制可能是AG490削弱了Stat3蛋白的表达和活化，引起一系列与细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡相关基因如BclxL与cyclinD1等的表达紊乱，进而诱导细胞的增殖抑制和凋亡增加. 其他研究结果表明［4-6］，各种方式阻断Stat3信号通路以后，肿瘤细胞中Stat3下游抗凋亡基因BclxL与cyclinD1的表达也受到阻断，细胞发生凋亡. 我们应用反义技术在喉癌中阻断Stat3信号通路的研究结果也是相符合的［7］. 本实验结果表明AG490+DDP作用于喉癌细胞系Hep2细胞72 h后，喉癌细胞系Hep2细胞中Stat3，pStat3，BclxL及cyclinD1表达水平较单纯化疗明显下降，由于喉癌对化疗药物属中低度敏感，表明喉癌细胞耐药可能与Stat3异常激活有关， JAK激酶抑制剂AG490可以协同化疗药物DDP对在喉癌Hep2细胞起治疗作用.
　　JAKs作为上游激酶介导Stats信号传导通路活化的机制是：JAK激酶活化后募集胞浆中以单体存在的Stats分子，使与受体结合的Stat分子酪氨酸磷酸化后，Stats形成同源或异源二聚体从受体上释放下来，进入细胞核与特异的DNA序列结合启动靶基因转录［8］. 我们发现BclxL蛋白表达水平在AG490作用后逐渐降低，细胞凋亡明显增加，BclxL可以抑制多种凋亡诱导因素介导的细胞凋亡. 本实验结果提示AG490对Hep2细胞的促凋亡作用和JAK2Stat3BclxL途径有关. 总之， Stat3信号传导通路在喉癌细胞中的转录调控机制尚不清楚，Stat3的异常激活与喉癌细胞耐药关系还有待于进一步明确.

参考文献

［1］ Hebenstreit D， HorejsHoeck J，Duschl A. JAK/STAT dependent gene regulation by cytokines ［J］. Drug News Perspect，2005，18(4):243-249.

［2］ Hodge DR， Hurt EM， Farrar WL.The role of IL6 and STAT3 in inflammation and cancer ［J］. Eur J Cancer， 2005， 41(16):2502-2512.

［3］ 王俊阁，李晓明，陈英会，等. 信号转导子和转录激活因子3在喉癌组织中的表达及临床意义［J］.临床耳鼻咽喉头颈外科杂志，2007，21(3):113-115.

［4］ Song L， Turkson J， Karras JG， et al. Activation of STAT3 by receptor tyrosine kinases and cytokines regulates survival in human nonsmall cell carcinoma cells［J］. Oncogene， 2003， 22(27): 4150-4165.

［5］ Yu H， Love R. The STATs of cancernew molecular targets come of age［J］. Nat Rev Cancer， 2004， 4(2): 97-105.

［6］ Kusaba T， Nakayama T， Yamazumi K， et al. Expression of pStat3 in human colorectal adenocarcinoma and adenoma correlation with clinicopathological factors［J］. J Clin Pathol， 2005， 58(8): 833-838.

［7］ 王俊阁，李晓明，陈英会，等. 信号转导子和转录活化因子3反义寡核苷酸联合化疗调控喉癌细胞增殖与凋亡的分子机制 ［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志， 2007，42(3):222-226.