关于免疫抑制宿主巨噬细胞Toll样受体的表达变化

　　　　　　　　 作者：顾克菊　马越云　苏明权　郝晓柯　于文彬

【摘要】 　　目的： 检测小鼠腹腔巨噬细胞TLRs表达情况及糖皮质激素甲基强的松龙对TLRs mRNA表达的影响. 方法： 应用RTPCR检测正常小鼠腹腔巨噬细胞TLR113的表达；并以甲基强地松龙为免疫抑制剂，诱导小鼠免疫抑制后检测腹腔巨噬细胞TLRs mRNA表达变化. 结果： 已发现的TLR113在正常小鼠腹腔巨噬细胞均有表达；小鼠腹腔巨噬细胞经糖皮质激素处理后，部分TLRs在mRNA水平上可被上调. 结论： Toll样受体是抗真菌先天免疫的重要组成部分. 甲基强的松龙对巨噬细胞有毒性作用，甲基强的松龙注射后可导致小鼠腹腔巨噬细胞明显减少.
【关键词】 小鼠；泼尼松龙；免疫抑制法；Toll样受体
　　【Abstract】 AIM: To test the expression of tolllike receptor 113 (TLR113) mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice and the change of TLRs mRNA expression in peritoneal macrophages of immunosuppressed mice. METHODS: The expression of TLR113 mRNA in the peritoneal macrophages of normal mice was determined by RTPCR technique. Immunosuppressed mice were induced by intraperitoneal injections of prednisolone. The expression of TLRs mRNA in the peritoneal macrophages of immunosuppressed mice was tested with RTPCR. RESULTS: All thirteen of the TLRs reported to date were present in the macrophages of normal mice. Some of TLRs were upregulated in mRNA level when the mice were treated with glucocorticoids. CONCLUSION: TLRs are important component parts of innate immunity to fungal infections. Prednisolone has a toxic effect to macrophages and decreases the peritoneal macrophages of the mice.
　　【Keywords】 mice; prednisolone; immunosuppression; tolllike receptor
　　0引言
　　Toll受体在果蝇的发育和抗真菌免疫中具有显著作用. 实验证实TLRs(tolllike receptors)表达异常会使免疫炎症反应不能正常发生，降低机体对病原微生物的清除能力［1］. 糖皮质激素(glucocorticoids， GC)可有效控制炎症和抑制免疫反应［2］. 近20年来，由于应用糖皮质激素而致机体免疫机能低下的患者患侵袭性曲霉菌病日趋增多. 体内外实验显示糖皮质激素在免疫和炎症应答中有促进和抑制作用，甚至出现双向作用［3］. 为了解糖皮质激素对TLRs表达的影响，我们以甲基强地松龙为免疫抑制剂，在诱导小鼠免疫抑制后检测腹腔巨噬细胞TLRs mRNA的表达情况.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　Balb/c小鼠24只，雌性，6～8周龄，体质量20～25g（第四军医大学实验动物中心）. 总RNA提取试剂TRIZOL  Reagent（Gibco公司），MMLV Reverse Transcriptase 和Reverse Transcription System(Promega 公司)，Taq DNA聚合酶和dNTPs(TaKaRa公司)，不完全RPMI1640( Life Technology公司)，甲基强的松龙，40 mg/支(比利时法玛西亚普强公司).
　　1.2方法
　　1.2.1糖皮质激素诱导小鼠免疫抑制及腹腔巨噬细胞计数
　　将免疫抑制组小鼠12只皮下注射甲基强的松龙100 mg/kg·d， 共3 d. 正常对照组小鼠12只皮下注射同体积注射用水. 第4日脱颈处死小鼠，浸泡于750 mL/L 乙醇1 min，剪开腹部皮肤，暴露腹部，用注射器吸取5 mL无血清RPMI1640培养液注入腹腔，轻揉腹腔1～2 min，用吸管吸取腹腔巨噬细胞悬液，移入离心管中计数.
　　1.2.2细胞总RNA的提取
　　收集腹腔巨噬细胞悬液，2000 g离心10 min，弃上清，RPMI1640洗涤1次. 用TRIZOL  Reagent一步法提取巨噬细胞总RNA.

　　1.2.3TLR1~13 PCR引物
　　根据GenBank公布的TLR1～13（除TLR10）已知序列设计引物，由上海生工生物工程技术服务公司合成（表1）. 表1基因名称和序列（略）
　　1.2.4RTPCR扩增TLR1～13基因及内参照βactin基因按照说明书，以Random Primers为引物，将从小鼠腹腔巨噬细胞中提取的总RNA逆转录合成cDNA. 分别用TLR及内参照βactin两组引物进行PCR扩增，反应条件为：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30s，循环32次，延伸7 min.
　　1.2.5扩增产物检测取10 μL PCR产物，15 g/L 琼脂糖凝胶电泳40 min，随后在凝胶成像系统中分析电泳带的吸光度值. TLRs的相对含量为TLRs与内参βactin吸光度比值表示.
　　统计学处理：实验结果以x±s表示，两组间差异比较用t检验，多组间比较采用KruskalWallis H检验.
　　2结果
　　2.1小鼠腹腔巨噬细胞数量变化将甲基强的松龙注射后，小鼠腹腔巨噬细胞数量由（6.3±1.8）×106/只降至（3.2±0.6）×106/只，前后比较有统计学差异（P&<0.01）.
　　2.2TLR113在正常小鼠腹腔巨噬细胞的表达经RTPCR检测，TLR113在小鼠腹腔巨噬细胞均有表达(图1).
　　2.3免疫抑制状态下小鼠腹腔巨噬细胞TLRs的表达变化糖皮质激素可上调巨噬细胞上部分TLRs mRNA表达(图1)，包括TLR2，3，4，5，6，8. 表达量增加约1.2～2.0倍(表2). 若&<1.2倍，综合评价为“无差异”，若≥1.2倍，综合评价为“上调”. 表2免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞TLRs mRNA表达（略）
　　3讨论
　　TLRs在不同组织细胞的表达各异 ，可分为广泛表达、限制性表达或特异性表达［4］，如TLR1分布于各类免疫细胞，TLR2，4，5只在髓源性细胞表达，TLR3则主要表达于树突状细胞. 小鼠腹腔巨噬细胞为常驻巨噬细胞，是防御病原微生物入侵的第一道防线. Muzio 等［5］研究显示， 单核/巨噬细胞在发育成熟的不同阶段表达大多数TLRs，但不表达TLR3. 我们的结果证明TLR113在小鼠腹腔巨噬细胞均有表达，包括TLR3. 当局部受到细菌、真菌及病毒感染时，巨噬细胞上的TLRs可识别不同的病原体相关分子模式如细菌脂肽、dsRNA，LPS和细菌鞭毛等并被活化，提供迅速而有效的先天免疫应答并启动获得性免疫应答.

　　多种病原微生物成分或细胞因子可上调或下调TLRs表达，如LPS可诱导TLR2，TLR4及TLR9的表达，IL6可使TLR7的表达明显升高，INFγ可上调TLR9的表达. Renshaw等［6］研究证实，老龄小鼠的脾细胞和腹腔巨噬细胞TLR1～9的表达显著减少，且TLRs功能下降，这可能部分解释老年人对各种病原菌感染的易感性增加. 糖皮质激素是广泛应用的抗炎剂，其抗炎效应的发挥是通过下调依赖NFκB的大量炎症应答相关基因的转录，而TLRs的上调可诱导NFκB的活化［7］. 研究发现，大剂量应用糖皮质激素是机会性真菌易感的主要危险因素之一，理论上推测糖皮质激素可能下调TLRs表达. 我们的结果显示，甲基强的松龙在mRNA水平上调巨噬细胞部分TLRs表达，其调节机制还不十分清楚. Homma等［8］研究了地塞米松对呼吸道上皮细胞TLRs家族成员表达的调节，发现地塞米松可上调TLR2～6的表达，与我们的研究结果相一致. Shuto等［7］研究证实，地塞米松协同增强非典型流感嗜血杆菌诱导的TLR2上调，是通过p38MAPK信号途径的负调节. Franchimont等［9］将地塞米松加入LPS刺激的全血细胞培养中，发现地塞米松可增加IL10的分泌，而降低TNFα的分泌，证明了糖皮质激素可强烈抑制Th1细胞促炎因子的分泌，而对Th3细胞抗炎因子的分泌有正调节作用. 糖皮质激素对巨噬细胞部分TLRs有上调作用，免疫功能低下患者易发生机会性感染，但究竟是通过对Toll样受体信号通路中哪些环节的抑制而发挥作用的？糖皮质激素上调部分TLRs表达的准确分子机制是什么？这将有待于进一步研究.
　　
　　以往研究认为，糖皮质激素可明显改变单核巨噬细胞的功能，能抑制巨噬细胞的吞噬和加工处理抗原功能，阻止单核细胞分化为巨噬细胞. 我们在实验中观察到糖皮质激素甲基强的松龙对巨噬细胞的毒性作用，甲基强的松龙注射后可导致小鼠腹腔巨噬细胞明显减少，RAW264.7细胞经甲基强的松龙作用后细胞生长受到抑制甚至死亡. 尚未见文献报道糖皮质激素对巨噬细胞的直接毒性作用，甲基强的松龙抑制巨噬细胞生长或诱导死亡可能是免疫抑制小鼠对烟曲霉菌易感的机制之一.
【参考文献】
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　　［2］Ashwell JD， Lu FW， Vacchio MS. Glucocorticoids in T cell development and function［J］. Annu Rev Immunol， 2000，18:309-345. Review.

　　［3］Galon J， Franchimont D， Hiroi N， et al. Gene profiling reveals unknown enhancing and suppressive actions of glucocorticoids on immune cells［J］. FASEB J， 2002，16(1):61-71.

　　［4］Zarember KA， Godowski PJ. Tissue expression of human Tolllike receptors and differential regulation of Tolllike receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes， their products， and cytokines［J］. J Immunol， 2002，168(2):554-561.

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　　［6］Renshaw M， Rockwell J， Engleman C， et al. Cutting edge: impaired Tolllike receptor expression and function in aging［J］. J Immunol， 2002，169(9):4697-4701.

　　［7］Shuto T， Imasato A， Jono H， et al.. Glucocorticoids synergistically enhance nontypeable Haemophilus influenzaeinduced Tolllike receptor 2 expression via a negative crosstalk with p38 MAP kinase［J］. J Biol Chem， 2002，277(19):17263-17270.

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