关于hSDF 1α/CXCR4介导骨髓源间充质干细胞迁移的信号转导

　　　　　　　　 作者：王新均，唐俊明，孔霞，郭凌郧，杨建业，郑飞，陈龙，黄永章，王家宁

【摘要】 　　目的：利用Boyden chamber体外迁移体系初步探索基质细胞衍生因子1(SDF1)在骨髓源间充质干细胞（MSC）迁移中的作用及其信号转导机制. 方法：采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC， 通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD133，CD34，CD90，CD105）等鉴定MSC特征；以P3MSC为实验材料，利用Boyden chamber体外迁移体系，观察不同浓度的hSDF1对MSC迁移的影响，以50 nmol渥曼青霉素，10 mmol LY294002，50 mmol PD98059，10 mmol U73122，0.1 g/L AMD3100等不同处理P3MSC，观察最适宜浓度的hSDF1对MSC迁移影响的信号转导机制. 结果：培养的MSC呈现出CD90，CD105强阳性，具有成骨、成脂肪等多向分化能力； MSC体外迁移能力随着hSDF1α浓度（1，10，100，500 μg/L）的递增而逐渐增强，并且hSDF1α浓度在100 μg/L时，MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值；渥曼青霉素，LY294002，PD98059，U70312，AMD3100，维拉帕米对MSC迁移均有影响，其中U73122，AMD3100对MSC迁移阻断的效应最显著. 结论：SDF1/CXCR4所介导的MSC迁移与丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关， 且PKC途径可能处于中心环节.
【关键词】 间充质干细胞；迁移;蛋白激酶C；信号转导
　　【Abstract】 AIM: To explore the role of stromal cellderived factor1 (SDF1) in the migration of mesenchymal stem cell (MSC) and its signal transduction mechanism. METHODS: MSC culture was performed with the classical whole bone marrow adhering method; characteristics of MSC were identified through the induction of multipledifferentiation into osteoblasts or lipoblasts， and surface marker assay (CD133， CD34， CD105); by using Boyden chamber in vitro migration assay system， the effects of SDF1 concentrations on P3 MSC migration were observed and the signal transduction pathways related to P3MSC migration were analyzed. RESULTS: Cultured MSC had the potential of menbranedifferentiation and highly expressed CD105 and CD90; the efficiency of MSC migration into the filter membrane increased gradually with the increase of hSDF1concentration （1， 10， 100， 500 μg/L）， and MSC number in the filter membrane was approximately maximum when hSDF1 was 100 μg/L. 50 nmol wortmannin， 10 mmol LY294002， 50 mmol PD98059， 10 mmol U73122 and 0.1 g/L AMD3100 were all able to decrease the number of MSC in the filter membrane， and whats more， U73122 and AMD3100 treatments were most effective in blocking the MSC migration. CONCLUSION: SDF1/CXCR4mediated MSC migration is related to mitogen activated protein kinase ( MAPK)， phosphatidylinositol phospholipase C (PIPLC) and protein kinase (PKC) signal pathways， but PKC signal pathway may be the central role in MSC migration.
　　【Keywords】 mesenchymal stem cell; migration; PKC; signal transduction
　　0 引言
　　研究已发现，骨髓来源的间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell， MSC）在一定条件下可以分化为心肌、成骨、软骨、脂肪、胰岛、肌腱等多种类型的细胞. 在心肌内、静脉内、冠脉内等不同途径移植MSC或粒系集落刺激因子动员骨髓，发现其可以迁移到心肌梗死部位，通过参与血管新生、心肌再生等改善修复受损的心脏［1］. 目前有关MSC迁移至心肌部位的机制仍不清楚. 有研究发现，表达CXCRA的造血干细胞（hemotopoietic stem cell，HSC）能够沿着基质细胞衍生因子1（stromal cellderived factor1， SDF1）的浓度梯度迁移实现迁移归巢过程［2］. 新近的研究发现MSC也表达CXCR4［3］. 我们研究体外迁移体系SDF1对MSC迁移的影响，初步探索MSC的迁移机制是否与HSC具有类似的特征.
　　1 材料和方法
　　1.1　材料
　　SPF级Wistar大鼠3只，体质量（230±20）g，动物合格证号为SCXK(鄂)2003005，实验动物使用许可证号为SYXK(鄂)2004021. 动物在屏障系统环境下，用专用饲料和灭菌水分笼饲养（湖北省实验动物中心提供）. DMEM培养基（美国Gibcol/BRL公司）； 胎牛血清（杭州四季青工程材料研究所）；胰酶（美国Sangon公司）；CO2细胞培养箱（美国Scientific公司）；倒置荧光显微镜(日本Nikon公司)；恒低温切片机(德国Leica公司)； 图像分析系统5.02(美国Media Cybernetics公司）；hSDF1α（upstate）；地塞米松，β磷酸甘油，维生素C，胰岛素，4，6联脒2苯基吲哚（4，6diamidino2phenylindoledi acetate，DAPI)，SDF1特异性受体CXCR4阻断剂AMD3100，维拉帕米(verapamil)（美国Sigma公司）；CD105，CD90，CD133和CD34，磷酰肌醇3激酶阻断剂渥曼青霉素（Alexis biochemicals），LY294002，丝裂原活化蛋白激酶阻断剂PD98059（Bioscience），磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C特异性阻断剂U73122（Bioscience），微孔聚碳酸酯膜（美国Millipore公司）.
　　1.2　方法
　　1.2.1　MSC的培养［1］
　　采用全骨髓法. 给予大鼠腹腔注射肝素5000 U， 15 min后断颈处死， 收集双侧胫股骨中全骨髓. 按1×109细胞/L接种于75 cm2培养瓶，24 h后换液，去除未贴壁的细胞. 以后3～4 d完全换液1次， 12～14 d后细胞密度达80%～90%， 用2.5 g/L的Trypsin消化后1∶3传代， 记为P1代MSC(P1MSC). 随后按上述方法传代培养. 培养的P3代MSC(P3MSC)中加入终浓度为50 mg/L的DAPI温育1 h，荧光显微镜下观察其DAPI标记的效率为100%［1］. 消化收集P3代的MSC(P3MSC)，制成1×109/L细胞悬液，以备迁移实验. 细胞培养条件：含150 mL/L的胎牛血清，1×105/L青霉素，100 mg/L链霉素和0.25 mg/L两性霉素B的DMEM培养基，37℃， 50 mL/L的CO2饱和湿度.
　　1.2.2　MSC的鉴定
　　1.2.2.1　成骨诱导
　　P3MSC培养至90％融合后6孔板加入成骨诱导液(150 mL/L FBSDMEM，含地塞米松4×10-6 g/L，β磷酸甘油1 g/L，维生素C 0.5 g/L)，每72 h换液，诱导2 wk. Von Kossas染色鉴定矿化结节.
　　1.2.2.2　成脂肪诱导P3MSC培养
　　至90％融合后6孔加入成脂肪诱导液(10 mg/L胰岛素)， 每72 h换液. 苏丹Ⅲ染色鉴定脂肪细胞.
　　1.2.2.3　流式细胞术鉴定
　　MSC表面标记特征用1 mL注射器将MSC（密度为1010/L）吹打混匀后，取600 μL（至少含有2×106个细胞），等分为4份，分别加入4个Eppendorf管中. a管为标准对照，加入4 μL大鼠IgG1FITC及4 μL大鼠IgG1PE mAb（荧光二抗）；b管加入4 μL CD34FITC和4 μL CD133PE mAb（一抗）；c管加入4 μL CD90 mAb（一抗）；d管加入4 μL CD105 mAb（一抗），4℃下避光孵育40 min，洗涤液1000 r/ min，离心5 min，用PBS洗1～2 次. 在c，d管中加入8 μL大鼠IgG1FITC（荧光二抗），4℃下避光孵育20 min. 洗涤液洗2次. 加入固定液1 mL，上流式细胞仪检测表面标志，应用Cotfit软件分析结果.
　　1.2.3　体外迁移实验
　　利用Boyden chamber体外迁移体系［4］，滤膜为微孔聚碳酸酯膜（直径为13 mm，孔径为8 μm）， 上层体系为250 μL 20 mL/L FBS的DMEM培养基，其中含1×108 P3MSC/L. 下层体系为250 μL 20 mL/L FBS的DMEM培养基，其中分别含有1，10，100，500 μg/L等不同浓度的hSDF1α. 置于培养箱中60 min. 取滤膜， PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，荧光显微镜下观察膜上细胞数. 随后分别用渥曼青霉素(50 nmol)，LY294002(10 mmol/L)，PD98059(50 mmol/L)，U73122(10 mmol/L)，AMD3100(0.1 g/L)，钙通道阻断剂维拉帕米(50 nmol/L)处理P3MSC 30 min，再次利用上述体系方法观察最适浓度的hSDF1α对MSC迁移的影响. 最后每张滤膜显微镜镜下随机视野5个视野，数码成像，转入图像5.02分析系统计算滤膜表面MSC细胞数.
　　统计学处理：所有实验数据以x±s表示，组间计量资料采用方差分析， P&<0.05为差异具有统计学意义.
　　2　结果
　　2.1　MSC的鉴定MSC具有成骨、成脂肪等多向分化潜能（图1，2）. 流式细胞仪分析表明MSC低表达CD34（1.5%），CD133（1.8%）；高表达CD90（96%），CD105（97%）.
　　2.2　MSC的培养
　　由于造血干细胞不贴壁生长， 经过数次换液， 悬浮的HSC逐渐被清除， 贴壁MSC呈匀一梭形成纤维细胞样形态，呈集落生长，增殖迅速. 原代MSC潜伏期约2～4 d，对数生长期3～5 d， 此后进入平台期. 传代MSC潜伏期较短约1～2 d， 对数生长约3～4 d， 可连续传4～6代. 一般原代细胞4～5 d可传代， 传代细胞2～3 d可再次传代.
　　2.3　hSDF1α对MSC迁移的影响
　　1，10，100，500 μg/L等不同浓度的hSDF1α对MSC迁移的影响呈现浓度依赖性，其中hSDF1α在100 μg/L时MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值（图3）.

转贴于 　　2.4　hSDF1α影响
　
　　MSC迁移的信号机制磷酰肌醇3激酶阻断剂渥曼青霉素和LY294002，MAPK阻断剂PD98059，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C特异性阻断剂U73122，SDF1特异性受体CXCR4阻断剂AMD3100等处理后的MSC迁移能力均有所降低，其中U73122，AMD3100对MSC迁移阻断的效应最显著（图4）.
　　3　讨论
　　SDF1属于趋化因子CXCL亚家族成员. 人类SDF1基因位于第10号染色体长臂. SDF1及其特异性受体CXCR4与HSC的动员迁移密切有关. SDF1主要在骨髓基质细胞中表达. SDF1的受体CXCR是一个有7个跨膜结构的G蛋白偶联受体，其基因定位于第4号染色体. 而研究发现骨髓中EPC，MSC表面也广泛表达CXCR4［5-7］.
　　我们选用具有多向分化潜能的MSC作为实验材料，并采用最新的鉴定MSC的标准［8］. 利用Boyden chamber体外迁移体系，检测hSDF1α对MSC迁移能力的影响，按体外迁移实验分组分别进行了3次实验. 本方法具有可重复性，以hSDF1α对MSC迁移的影响为例，计算反应误差相互关系为判定本方法的重复性. 图2显示hSDF1α可明显影响MSC的迁移，呈现hSDF1α浓度依赖的特征，且hSDF1α在100 μg/L时MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值. 随后观察在100 μg/L hSDF1α作用时，MSC迁移的信号转导机制. 从结果3显示：SDF1特异性受体CXCR4阻断剂AMD3100干预MSC后，迁移到滤膜上的MSC细胞数显著减少，证实了hSDF1α对MSC迁移的影响是通过SDF1及其配体CXCR4的交互作用实现的. 随后分别阻断SDF1与CXCR4结合后所激活的CXCR4偶联的G蛋白下游信号途径发现：磷酰肌醇3激酶阻断剂渥曼青霉素和LY294002， MAPK阻断剂PD98059干预MSC后，MSC的迁移与对照组比较差异具有显著性，表明MSC迁移能力的调控与PI3KMAPK途径有一定的关系. 近来研究表明PI3KMAPK途径下游所激活的基质金属蛋白酶与SDF1/CXCR4介导的MSC迁移有关［9-11］. 而磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C特异性阻断剂U73122干预MSC后，MSC的迁移与对照组比较差异具有显著性，表明MSC迁移能力的调控与PIPLC途径关系更密切. 尤其是U73122干预的MSC与AMD3100干预的MSC迁移能力相比也存在显著性差异，以U73122干预的MSC迁移到滤膜上的MSC细胞数减少为最显著. 上述结果与Petit等［9］所研究的SDF1α对HSC迁移的影响结果相似， 表明SDF1α与其受体CXCR4结合后，激活G蛋白偶联的PIPLC和PI3K，而PIPLC和PI3K又通过激活蛋白激酶C途径，随后再激活其下游与黏附相关的酪氨酸激酶和细胞外信号调节激酶等信号分子. 我们的研究结果显示MSC迁移能力的调控虽与PI3KMAPK途径有关，但与PIPLC途径关系更密切. 提示SDF1与CXCR4结合后，通过PIPLC和PI3K不同信号通路激活的蛋白激酶C（PKC）亚型不同. 已知特异性的PKC调节SDF1α所介导的HSC迁移［9］. 而PKC可由二酰基甘油(DAG)，钙，磷脂酰丝氨酸等激活，而DAG，钙，磷脂酰丝氨酸等是PIPLC激活后降解磷脂酰肌醇的产物如： DAG，磷脂酰丝氨酸或触发释放的物质如钙等. 有研究报道内皮细胞的迁移与其细胞内钙浓度增加密切有关［12］. 我们在利用钙通道阻断剂维拉帕米处理MSC后，其迁移能力明显比阻断PI3KMAPK途径降低得更显著. 可见，SDF1/CXCR4所介导的MSC迁移与PIPLCPKC途径有关，且PKC途径可能处于中心环节.
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