关于靶向于HER2的siRNA表达载体在人乳腺癌细胞SKBr3中的表达

　　　　　　　　　　 作者：鲍炜　张立红　付海京　贾林涛　张勇　刘家云　任新玲　温伟红　孟艳玲　王成济　杨安钢

【摘要】 目的：探讨针对HER2分子的RNA干涉对乳腺癌细胞生长的影响. 方法：人工合成DNA，经退火磷酸化后克隆入pSUPER载体. 基因转染后通过观察细胞形态和细胞计数等方法验证发夹状小干涉RNA(siRNA)对细胞生长状态的影响，以激光共聚焦检测基因表达情况. 结果：siRNA表达载体转染后可以引起SKBr3细胞大量死亡，间接免疫荧光检测出HER2蛋白表达降低. 结论：针对HER2进行RNA干涉可在体外抑制SKBr3细胞生长.
【关键词】 HER2；RNA干涉；基因治疗
　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of HER2targeted RNA interference (RNAi) on the growth of human breast carcinoma SKBr3 cells. METHODS: HER2targeted hairpin small interfering RNA (siRNA) genes were obtained by oligonucleotide synthesis and annealing of the complementary single strand DNAs. pSUPER vector harboring each of the above genes was transfected into SKBr3 cells in vitro. The expression of HER2 gene in the transfected cells was examined by RTPCR and indirect immunofluorescence assay， and the effect of the HER2targeted siRNA on cell growth and proliferation was evaluated by cell counting and morphological observation. RESULTS: Both RTPCR and indirect immunofluorescence assay revealed a remarkable decrease of HER2 expression in pSUPERsihe1 and pSUPERsihe2transfected cells， but not in pSUPER vector transfected cells. Cell proliferation was dramatically inhibited after the expression of the HER2targeted siRNAs as shown by microscopic observation and cell counting. CONCLUSION: HER2targeted RNAi in SKBr3 cells can effectively inhibit the expression of HER2 gene and the proliferation of the cells in vitro.
　　【Keywords】 HER2; RNA interference; gene therapy
　　0引言
　　目前，乳腺癌的死亡人数占到女性肿瘤的40%［1］. 研究表明许多肿瘤的发生都与特定癌基因或酪氨酸激酶受体基因过表达导致的细胞增殖有关. HER2受体已被证实是与乳腺肿瘤发生密切相关的受体［2］. HER2是由原癌基因ErbB2/neu/HER2编码的一种受体酪氨酸蛋白激酶，属表皮生长因子受体家族［3］. 近年来，HER2受体靶向的乳腺癌治疗倍受关注［4］. 对于HER2阳性的乳腺癌患者，已有针对HER2的商品化抗体Trastuzumab问世，但近来发现这种抗体具有无法克服的心脏毒性和其它副作用，因此其作用受到限制［5］. 将siRNA用于肿瘤细胞中可以特异性地抑制目的基因的表达， 从而有可能逆转细胞的恶性表型. 我们据此构建了针对erbB2/HER2/neu的siRNA表达载体，研究它们对人乳腺癌 SKBr3细胞中HER2表达的抑制作用以及HER2对细胞生长增殖的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　人乳腺癌细胞系SKBr3， 大肠杆菌 DH5α及pSUPER载体均为本室保存；T4 DNA连接酶、限制性核酸内切酶和DL2000 DNA Marker（TaKaRa公司）；新生牛血清、DMEM培养基、胰酶及脂质体lipofectAMINETM2000（Gibco公司）；RTPCR试剂盒（Invitrogen公司）. 仪器 BX60荧光显微镜（日本Olympus公司）；Alpha ImagerTM 1220凝胶成像系统（Alpha Innotech公司）；SUNRISE酶标仪（澳大利亚TECAN公司）；PE2400 PCR仪（美国Perkin Elmer公司）；5417R台式低温冷冻离心机、5415D Centrifuge台式高速离心机（德国Eppendorf公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1以HER2为靶分子的siRNA的设计及真核表达载体的构建根据人HER2基因设计4条寡聚脱氧核苷酸链（oligo），序列为: oligo1: 5′gatcccctgatagacaccaaccgctcttcaagag agagcggttggtgtctatcatttttggaaa3′；oligo2: 5′agcttttccaaaaatgatagacaccaaccgct ctctcttgaagagcggttggtgtctatcaggg3′；oligo3: 5′gatcccctgaaacctgacctctcctatt caagagataggagaggtcaggtttcatttttggaaa3′；oligo4: 5′ agcttttccaaaaatgaaacctgacc tctcctatctcttgaataggagaggtcaggtttcaggg3′. 由赛百盛公司合成.
　　取两条DNA在退火缓冲液中退火，95℃ 4 min，70℃ 10 min，缓慢降温到4℃. 退火缓冲液组分为：100 mmol/L醋酸钾，30 mmol/L HEPESKOH， 2 mmol/L醋酸镁. 取退火后的产物磷酸化，产物与经Hind III和Bgl II双酶切的pSUPER载体进行连接，连接产物命名为pSUPERsihe1， pSUPERsihe2，转化E.coli DH5α菌株，挑阳性克隆酶切鉴定，测序.
　　1.2.2真核表达载体的细胞转染转染前24 h将SKBr3细胞分别铺于6孔板，待细胞生长至约60%汇合时，按照lipofectAMINETM2000使用说明转染pSUPERsiRNA及pSUPER空载体. 倒置显微镜观察细胞状态.
　　1.2.3RTPCR检测HER2的表达RNA的提取按试剂盒说明书操作进行，模板总量5 μg，反转录酶16.67 nkat， 0.5 μL引物和10 mmol/L dNTP 1 μL，总体积20 μL， 42℃ 60 min. 取1 μL逆转录产物， 20 μmol/ L引物0.5 μL，10 mmol/L Taq DNA聚合酶(总体积50 μL)进行PCR. 反应参数为：94℃ 30 s， 55℃ 30 s， 70℃ 1 min，30个循环. 检测HER2的引物为：Mh1: 5′ctgtttgccgtgccaccctgagt 3′；Mh3: 5′cttctgctgccgtcgcttgatgag 3′. 以βactin 为内对照，引物为：ACTB1:5′tgcgcagaaaacaagatgagatt 3′；ACTB2:5′ tgggggacaaaaagggggaagg 3′，以10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定RTPCR产物.
　　1.2.4间接免疫荧光检测与激光共聚焦显微镜观察转染前24 h用胰酶消化SKBr3细胞，加1～2滴至12孔板中的盖玻片上，37℃孵箱放置1 h，使细胞贴壁，制成细胞爬片，待细胞达到80%汇合率时进行转染. 24 h后分别用以HER2为靶点的两个干涉载体及空载体进行瞬时转染，于转染后48 h取出，用PBS(pH 7.4)洗2次，加40 g/L多聚甲醛固定30 min，再以PBS洗２次，经0.1 mL/L Triton，3 mL/L双氧水灭活内源性过氧化物酶及血清封闭等处理后，依次加入适量稀释的一抗、二抗及SABCCy3；加一滴PBS封片，用荧光显微镜观察并照相.
　　1.2.5细胞计数分析于转染后1～4 d消化细胞，用血球计数板进行细胞计数.
　　2结果
　　2.1真核表达载体的鉴定将退火产物与经双酶切的载体连接，转化感受态细胞，挑取单克隆培养，小量提取质粒DNA，将干涉组质粒分别命名为pSUPERsihe1和pSUPERsihe2. 用EcoR I和Hind III双酶切，电泳后见到一条约291 bp的片段，表明退火后的siRNA基因已插入pSUPER载体中，测序结果完全正确（图1）.
　　2.2HER2靶向siRNA对目的基因表达的抑制以构建成功的质粒瞬时转染SKBr3细胞，48 h后提取总RNA， 并取相同量的模板进行反转录PCR，干涉组的条带比实验组明显暗淡(图2). 取干涉效果较好的pSUPERsihe2转染细胞进行间接免疫荧光试验，激光共聚焦显微镜观察表明实验组细胞表面HER2分子表达明显减少(图3).
　　2.3HER2靶向siRNA表达抑制体外SKBr3细胞生长以pSUPER空载体作为对照，用pSUPERsihe2转染后发现，实验组细胞在转染后第2日开始部分细胞形态及折光性变差，有少量细胞死亡(图4). 随着后死亡细胞逐渐增多，漂浮于培养液中. 细胞计数结果显示转染实验组细胞生长受到抑制，细胞增殖缓慢(图5).
　　3讨论
　　在乳腺癌、 卵巢癌及胃癌等多种恶性肿瘤中， 由于基因扩增， 转录激活等原因， HER2表达水平高出正常细胞上百倍. 成为一种公认的肿瘤标记物（乳腺癌(25%～30%)， 卵巢癌(25%～32%)， 肺腺癌(30%～35%)， 原发性肾细胞癌(30%～40%)［6］. 研究表明，HER2的过表达与肿瘤的恶性程度和转移能力密切相关. 过表达的HER2可以与神经调节蛋白多肽类激素等配体结合. 通过激活Ras，MAPK等信号分子导致细胞过度增殖和癌变［7］. 因此，通过RNA干涉等方法抑制肿瘤细胞中HER2的表达，可以在一定程度上逆转细胞的恶性表型，抑制细胞过度增殖.

　　RNA干涉是一种广泛存在于高等动植物中的由双链RNA介导的转录后基因沉寂（PTGS）现象［8-10］. 在肿瘤基因治疗中，通过人工合成特定癌基因靶向的siRNA，或构建上述siRNA的表达载体，并将它们导入肿瘤细胞中，可以特异性地抑制目的基因的表达. 我们针对HER2 mRNA的２个靶点，即gagcggttggtgtctatca和taggagaggtcaggtttca核苷酸序列，设计了２个发夹状siRNA分子，并构建了该siRNA的表达载体pSUPERsihe1和pSUPERsihe2.通过脂质体转染进入了人乳腺癌SKBr3细胞后，该载体在H1启动子的调控下表达siRNA［11］. 诱发针对HER2的干涉反应. 我们通过RTPCR和间接免疫荧光检测证实，转染siRNA表达载体的细胞中HER2的表达受到显著抑制，其中RTPCR结果显示针对HER2 mRNA 2个靶位点的siRNA对HER2的抑制分别达到了90%和95%，这表明，虽然由于mRNA本身存在二级结构等原因，并不是针对mRNA所有靶位点的siRNA都能有效地诱发针对靶mRNA的干涉反应，但我们在研究中选择的针对HER2 mRNA靶位点的siRNA均可以高效地诱导HER2靶向的RNA干涉反应. 同时，光学显微镜下观察发现，与空载体转染组相比，siRNA表达载体转染细胞生长状态变差，很多细胞发生死亡. 细胞计数结果显示，siRNA的表达明显抑制了细胞的生长和增殖.
　　
　　因此，应用RNA干涉技术可以有效地抑制人乳腺癌SKBr3细胞等恶性肿瘤细胞中HER2的过表达，阻断HER2介导的细胞信号转导途径，从而抑制肿瘤的过度增殖. 本研究可望为HER2阳性肿瘤的基因治疗提供一种新思路.
　
　基金项目：国家重点基础研究发展(973)计划项目(2004CB518805)；教育部“长江学者和创新团队发展计划”（IRT0459）；国家自然科学基金(30500592)
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