关于血红素氧化酶1在协调性异种心脏移植中的作用

　　　　　　　　 作者：王博 吕毅 张晓刚 李晖 仵正 潘承恩

【摘要】 目的：探讨血红素氧化酶1在协调性异种心脏移植中的作用及其机制. 方法：建立金黄地鼠对大鼠异种心脏移植模型. 随机将实验动物分为4组：对照组、环孢素组、脾切除组、脾切除＋环孢素组. 观察异种移植物的生存时间. HE染色观察各组移植物组织病理学改变. 免疫组化染色观察各实验组不同时间移植物组织中NFκB， Pselectin， HO1的表达情况. 结果：脾切除组移植物生存时间较对照组和环孢素组延长. 脾切除联用环孢素较其它组移植物生存时间延长. 移植心脏发生排斥反应时，移植物组织中NFκB， Pselectin表达呈阳性. 长期存活的移植心脏组织中HO1表达阳性，未见到NFκB， Pselectin表达. 结论：异种移植物血管内皮细胞HO1表达上调对移植物长期存活有一定意义，对移植物血管内皮细胞具有一定的保护作用.
【关键词】 异种移植；心脏；环孢素A
　　【Abstract】 AIM: To investigate the role of Heme oxygenase1 (HO1) in the protection of xenograft endothelium and its mechanism. METHODS: Hamster to rat cardiac transplantation model was constructed. The animals were pided into 4 groups randomly: control group， cyclosporine A (CsA) group， splenectomy group， splenectomy＋CsA group. Hamster heart was transplanted into rat abdominal cavity. The survival time of the xenografts were monitored. The histological changes of the xenogafts were investigated by HE staining. HO1， NFκB and Pselectin expressions were detected immunohistochemically in the xenografts of different groups. RESULTS: The survival time of the xenografts in the splenectomy group was longer than that in the control group and CsA group. The survival time of the xenograft in the splenectomy+CsA group was prolonged significantly as compared with the other group. NFκB and Pselectin expressions were observed in the rejected xenografts. HO1 expression was positive in the endothelial cells of longterm survived xenografts in the splenectomy＋CsA group. However， no evidence of NFκB and Pselectin expression was discovered. CONCLUSION: Upregulation of HO1 can protect endothelium of the xenograft， which is vital to the longterm survival of the xenograft.
　　【Keywords】 transplantation， heterologous; heart; cyclosporine A
　　0引言
　　移植排斥反应仍是目前异种移植亟待解决的难题. 近年来，人们通过对受者和/或供体进行一些免疫干预如去除或抑制异种反应性抗体、补体、转基因等方法可以成功抑制超急性排斥反应的发生. 然而，急性血管排斥反应（acute vascular rejection， AVR）或迟发型异种排斥反应（delayed xenograft rejection， DXR）将会使移植物在移植后数天或数周之后失去功能［1］. 急性血管排斥反应已经成为异种移植应用于临床的最大障碍之一. 实验研究证实血红素氧化酶1（heme oxygenase1， HO1）具有一定的抗氧化、抗炎作用［2］. 在协调性异种移植中，移植物仅发生急性血管排斥反应. 本试验中，我们将通过建立金黄地鼠对大鼠协调性异种心脏移植模型，探讨HO1对移植物血管内皮细胞的保护作用.
　　1材料和方法
　　1.1动物分组
　　供体为健康成年金黄地鼠45只， 80～100 g，雌雄不拘. 受体SD大鼠45只，180～200 g，购自西安交通大学医学院实验动物中心. 采用“双套入”法建立金黄地鼠对SD大鼠协调性异种心脏移植模型［3］. 将实验动物随机分为4组： A组：对照组（n=10），不予任何治疗措施. B组：环孢素组（n=10），移植当日起每日腹腔注射环孢素10 mg/kg. C组：脾切除组（n=10），移植心脏复跳后即予以脾切除. D组：脾切除＋CsA组（n=15），移植心脏复跳后即予以脾切除，移植当天起每日腹腔注射环孢素10 mg/kg.
　　1．2术后处理与观察每组随机选取5例实验动物观察移植心脏存活时间. 移植心脏复跳至停跳的时间为异种移植物存活时间. 移植心脏存活时间大于30 d认为长期存活. 移植物在3日内停跳，视为手术失败.
　　1．3组织标本的采集分别于移植术后1， 2， 3， 7， 14和30 d剖杀动物，切取移植心脏. 将供体心脏组织置于40 g/L甲醛液中固定，石蜡包埋.
　　1．4HE染色光学显微镜下观察组织病理学改变.
　　1．5免疫组化染色观察移植物组织中HO1， NFκB， Pselectin表达情况免疫组化染色采用Elivision二步法. 移植物血管内皮细胞和血管平滑肌细胞质有棕黄色颗粒样物质为阳性表达.
统计学处理：定量资料用x±s表示，各组移植物生存时间比较用SPSS10.0统计软件进行非参数秩和检验. P&<0.05认为有统计学差异.
　　2结果
　　2．1移植心脏存活时间脾切除组、脾切除＋CsA组移植物存活时间较对照组延长. 环孢素组移植物生存时间与对照组无统计学差异. 各实验组移植心脏存活时间(d): 对照组3.4±0.6， 环孢素组3.8±0.4， 脾切除组6.4±1.5， 脾切除＋环孢素组≥30.
　　2．2光镜下组织病理学改变对照组、环孢素组、脾切除组：移植心脏发生排斥反应时光镜下可见广泛血管内血栓形成伴心肌组织间大量出血. 心肌间可见单个核细胞、淋巴细胞浸润，以血管周为显著(图1).
　　脾切除+CsA组 术后第14日时，光镜下可见组织结构未见明显改变，组织间可见炎细胞浸润；移植术后第30日时，光镜下观察组织结构基本正常，未见血栓形成和出血，血管内膜增厚. 组织间有少量单个核细胞和淋巴细胞浸润(图2).
　　2．3移植物组织中NFκB， Pselectin表达情况对照组、环孢素组、脾切除组 移植心脏发生排斥反应时，血管内皮细胞和血管平滑肌细胞内可见大量棕黄色颗粒样物质，NFκB阳性表达(图3)；同时，可见移植物组织中Pselectin表达亦呈阳性(图4).
　　脾切除＋CsA组 心脏移植术后，取各时间段移植物行免疫组化染色，未发现血管内皮细胞和血管平滑肌细胞NFκB， Pselectin阳性表达.
　　2．4移植物组织中HO1的表达情况对照组、环孢素组、脾切除组分别在心脏移植术后各时间段取移植物组织进行免疫组化染色观察，均未见到HO1表达. 脾切除＋CsA组于移植术后7 d，移植物组织中开始有HO1表达，14 d， 30 d，均可见到移植心脏血管内皮细胞及血管平滑肌细胞HO1表达(图5).
　　3讨论
　　排斥反应仍是异种移植的最大障碍之一. 根据移植物供者与受者间种属的远近，可将异种移植分为：非协调性异种移植（disconcordant xenotransplantation），如猪对人、豚鼠对大鼠异种移植. 协调性异种移植（concordant xenotransplantation），如狒狒对人、小鼠对大鼠、仓鼠对大鼠异种器官移植. 在协调性异种移植时，AVR开始于异种移植物再灌注的24 h内，并在数天或数星期内破坏移植物［4-5］. 其特点是传统免疫抑制剂效果不理想、大量异种反应性抗体在移植物血管内皮细胞表面沉着、以活化的巨噬细胞和NK细胞为主的大量炎细胞浸润［6-7］. 因此如何克服AVR，延长异种移植物的存活时间成为目前异种移植的热点.
　　HO是血红素转化为胆绿素、一氧化氮、自由铁（Fe2+）过程中重要的限速酶［8］. 目前发现的HO共有3个亚型：HO1， HO2， HO3. HO1除在脾脏中表达较高，其它组织中表达很少. 当细胞受到炎症、缺血、缺氧等损伤因素作用时，会引起HO1表达的上调，对细胞起到一定的保护作用. 近年来，研究认为HO1有四种主要作用：①抗氧化作用［2］. ②维持组织微循环血流稳定［9-10］. ③对细胞周期有一定的调节作用. ④抗炎作用. Vachharajani等［11］研究发现在内毒素引起的血管内皮细胞损伤过程中，HO1可以调节肺脏、肾脏、肝脏等组织中Pselection和Eselectin的表达从而影响白细胞浸润，减轻炎性反应. 在本实验中，脾切除＋CsA组长期存活移植物血管内皮细胞和平滑肌细胞有HO1的表达. 对照组、环孢素组、脾切除组各时间段移植物组织中没有发现HO1表达. 由此可见HO1的表达与异种移植物的长期存活有一定关系.

　　NFκB能够激活血管内皮细胞前炎性基因的表达上调，同时，NFκB活化可以促进细胞粘附分子如Pselectin等表达［12-13］，抑制NFκB可以抑制前炎性基因的表达. 粘附分子的表达有利于淋巴细胞、NK细胞、巨噬细胞的粘附、聚集、浸润，并引起微血管的通透性升高，组织水肿、出血等. 同时，粘附分子的表达也促进血小板活化、粘附、聚集与微血栓的形成［14-15］，NFκB和粘附分子的表达在促进异种移植急性血管排斥反应的发生过程中起到重要作用. 在本实验中我们通过对脾切除＋CsA组长期存活异种移植物组织免疫组化染色发现，在有HO1表达的移植物组织中没有NFκB、粘附分子Pselectin表达. 然而，在发生排斥反应的移植物组织中可见到NFκB， 粘附分子Pselectin表达. 同样在这些移植物组织中也没有发现HO1表达. 上述结果提示：移植物组织中HO1表达可能阻断了核转录因子NFκB的激活，从而抑制了内皮细胞激活和粘附分子的表达. 在一定程度上减轻了炎细胞浸润和血小板活化、粘附、聚集，对移植物血管内皮细胞起到一定的保护作用，抑制了AVR的发生.
【

参考文献

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