关于生长因子对骨髓基质干细胞诱导的成骨细胞的生物学作用

【摘要】 骨组织工程的三大关键问题是种子细胞，生物支架和生长因子. 骨髓基质干细胞可以被诱导为成骨细胞，在骨组织工程中被认为是比较理想的种子细胞. 生长因子对骨髓基质干细胞诱导的成骨细胞作用机制的研究对骨组织工程的发展至关重要. 血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子、骨形成蛋白等生长因子对骨髓基质干细胞诱导的成骨细胞作用及机制在文中进行了逐一讨论.
【关键词】 骨髓细胞；成骨细胞；生长物质；组织工程
　　0引言
　　骨骼损伤、肿瘤等导致的骨缺损是骨科每天都要面临的问题，临床医生通常是通过自体或异体骨移植方法来解决缺损问题，但这种方法存在着来源有限、增加创伤、排斥反应及疾病传播等问题. 由于利用组织工程学原理与方法再生的骨组织植入体内无免疫排斥的危险且来源充足，因此它的优势逐渐得到认同［1］ . 近年来，组织工程迅猛发展并且是目前公认的最有可能在临床取得实际效益的研究领域之一［2］. 但是要真正广泛应用于临床，还必须解决好组织工程的三大关键问题即种子细胞、可降解的生物支架及生长因子. 骨髓来源的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells， MSCs)由于取材容易，易于体外培养和诱导，是目前最有前途成为组织工程种子细胞来源的细胞［3-4］. 组织工程是将细胞与材料复合，从而构建植入人体的活材料. 在此过程中，目的细胞的生长调控是十分重要的一环，因此对生长因子的作用及其机制的研究是组织工程的重要内容. 生长因子是通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多肽因子，它对细胞具有促进或抑制其分裂增殖、迁移和基因表达的作用. 生长因子对目的细胞作用有利于在体外构建与体内更为相似的模拟环境，从而为体内试验奠定基础.
　　1骨髓基质干细胞及成骨诱导
　　目前，骨组织工程种子细胞的分离主要有三种来源：骨髓来源、骨膜来源和松质骨来源［5］. 种子细胞的培养是骨组织工程的前提与基础. MSCs 由于其强大的增殖能力与多向分化潜能成为骨组织工程的种子细胞之一［6］.
　　
　　骨髓是由造血系统和基质系统组成的复合组织，它除了是造血干细胞的主要来源外，同时成人的骨髓组织中还存在着骨髓间质干细胞. 20世纪70年代中期，Friedenstein等［7］报道，骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落，这部分贴壁的细胞就是骨髓基质干细胞，也叫间质干细胞. 这种间质干细胞具有多方向的分化潜能，可以分化成为骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪等组织［8-9］. 间质干细胞的多向分化特性使之成为组织工程的理想细胞来源，是目前骨组织工程普遍选用的细胞. 近年来的许多组织工程研究均采用了人或动物的骨髓间质干细胞，其结果十分令人满意［10-11］.
　　
　　现有的MSCs培养方法主要为应用诱导剂 (地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸) 和生长因子进行诱导，但诱导效果均不甚理想. 国内外研究者发现， MSCs的分化具有位点特异性，即在何种微环境中培养MSCs，就倾向于向这类环境中的细胞分化. 根据MSCs分化的位点特异性，在骨组织工程中欲把MSCs诱导分化为成骨细胞，采用模拟成骨微环境来诱导MSCs的增殖与成骨分化可能也是一种有效的诱导方法［12-13］.
　　2骨组织工程相关因子
　　生长因子的合理应用对构建骨组织工程起着关键的作用. 骨组织拥有一个庞大的生长因子库，目前在骨组织中发现了十几种生长因子，已经发现有多种细胞因子对成骨过程具有重要的调节作用，可以诱导成骨、促进细胞增殖和胶原合成、促进成骨和血管生长以及在骨吸收改建方面发挥作用，因此在构建组织工程骨时对成骨因子合理使用或调控成骨细胞的适时适量表达十分重要.
　　2.1血管内皮生长因子VEGF又称血管通透因子(VPF)或（VAS），是近年来发现的一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，对胚胎发育及切口修复等生理功能有重要意义. VEGF是一种糖蛋白，其相对分子量为34~45 ku由两个相对分子量各为17 ~22 ku的不同亚单位组成的二聚体，VEGF就是由于该基因的剪切方式不同所形成的系列产物. 人至少有4种VEGF，分别为VEGF121， VEGF165， VEGF189和VEGF206. 近年来研究表明，血管内皮生长因子对中胚层细胞分化有作用，可以使骨髓基质干细胞向成骨分化. Midy等［14］发现，外源性VEGF能使体外培养的成骨细胞碱性磷酸酶(ALP) 活性及cAMP浓度提高4倍. VEGF诱导成骨细胞迁移，增加ALP活性，同时成骨细胞自身合成VEGF. PGE1， PGE2， 1， 25(OH)维生素D3及IGFⅠ能增加成骨细胞VEGF mRNA的表达.
　　２.２肿瘤坏死因子TNF是一种糖蛋白的低聚物，分子量为39~70 ku，是多功能的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和T细胞产生. TNF是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤细胞作用最强的生物活性因子之一. TNF分两大类：由活化的巨噬细胞产生的称为TNFα，由活化的T细胞产生的TNF称为TNFβ，它们共同作用于同一受体. TNF可刺激培养的成骨细胞和骨器官合成RNA和PGE2，TNF可以抑制胶原和骨钙素的合成以及1， 25(OH)维生素D3刺激的ALP活性，但它可刺激Ι型胶原mRNA表达，这说明TNF的这种胶原合成抑制作用受翻译后产物的调节［15］.

　　２.３骨形成蛋白BMP是广泛存在于骨基质中的一种酸性糖蛋白，是目前唯一被确认具有异位成骨能力的生长因子，它能在体内、外诱导骨髓基质细胞转化为成骨细胞，使高分化的骨细胞群体数量保持稳定. Okubo等［16］用支架材料与不同剂量的BMP复合后植入兔下颌骨的骨缺损中，3 wk后ALP和组织学检查发现新骨形成，证实BMP诱导成骨系软骨内化骨形成过程，且成骨量随BMP剂量增加而增加，有明显的剂量依赖性. 陈克明等［17］认为： BMP与纤维蛋白制成的复合物，具有良好的骨诱导活性. 载体包容BMP等诱导因子可有效缓慢的释放，以发挥其诱导作用. 余家阔等［18］认为，在BMP诱导下，无论是幼稚软骨细胞还是成熟软骨细胞都有表达成骨细胞表型的趋势. 目前认为BMP是骨组织工程中促进成骨作用最重要的一种，近年来BMP作为一种有价值的生长因子越来越受到人们的重视，然而其诱导成骨的机制目前却并不完全清楚. 但由于BMP在骨组织中含量极少且在体内扩散很快，容易被蛋白酶所分解，因而不能在局部发挥持续刺激和诱导成骨作用，其诱导活性难以得到充分的发挥［19］.

　　２.４转移生长因子TGFβ是一种有多种功能的单链多肽，分子量为25ku，具有对骨组织、结缔组织及免疫系统等细胞的调节功能，其调节作用包括细胞生长调节和分化诱导两方面. 目前发现有5种亚型，分别为TGFβ1~TGFβ5. TGFβ广泛存在于多种组织及转化细胞中，其中以骨组织、血小板、软骨组织中含量最丰富，而TGFβ受体在成骨细胞表达最多，表明TGFβ的主要作用是调节骨代谢. 有实验表明TGFβ对胶原基因表达和胶原的合成具有促进作用. TGFβ可促进细胞增殖与分化，促进细胞外基质合成，也是多种免疫细胞的自分泌或旁分泌的调节因子［20］.
　　
　　TGFβ为主要成骨因子之一，它诱导间充质细胞合成软骨特异性蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，刺激成骨细胞的增殖及胶原合成. TGFβ在体外对成骨细胞的作用很复杂，部分取决于TGFβ的浓度、细胞密度、种系和成骨细胞的分化阶段. 多数研究认为TGFβ能抑制成骨细胞游离钙的合成、增加成骨细胞分化以及成骨细胞胶原和ALP的表达. TGFβ对成骨细胞生长有调控作用，这种作用在一定程度上表现为双相性. 研究表明，含血清培养的成骨细胞，低浓度的TGFβ可以刺激细胞DNA和胶原合成，抑制ALP活性，刺激细胞生长；而高浓度则抑制胶原合成，对DNA合成无作用. 无血清培养的成骨细胞，高浓度TGFβ抑制ALP生成. 此外，也有研究表明，TGFβ促进骨髓源性和骨膜源性骨前体细胞趋化到骨软骨损伤部位，进而增生、分化形成成骨细胞和软骨细胞 ［21］.

　　2.5成纤维细胞生长因子FGF是一种对中胚层和神经外胚层细胞具有促有丝分裂作用的多肽生长因子. 它对成骨细胞具有促增殖作用，并且通过增殖骨细胞数目促进骨形成. FGF分为酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因(bFGF)两种. aFGF存在于骨细胞浸出物中，bFGF存在于牛和人的骨骼中，前者较后者低10倍. FGF是毛细血管增殖刺激剂，能够促进毛细血管向断端内以及骨移植物中长入，使骨修复早期的组织中软骨岛数量增加，并使骨折断端骨痂血管重建的时间提前，而且可以增加BMP的成骨量. 目前虽然FGF的作用机制还不是很清楚，但是可以肯定的是局部和全身应用FGF可以促进骨形成. bFGF是一种内源性多肽生长因子，有试验表明它能有促进中胚层和神经外胚层细胞有丝分裂的作用 ［22］.

　　2．6血小板源性生长因子PDGF 首先在血小板中发现，分子量为28～35 ku，由两个多肽键A和B组成异二聚体，在体外具有促进纤维细胞生长的作用，对所有起源于间叶细胞包括成骨细胞既能促进骨形成，又能刺激骨吸收，起双向调节作用［23］. PDGF还对中胚层细胞有促有丝分裂作用，它对人和鼠成骨细胞及其细胞系均有促有丝分裂作用. 同时它还是一个强力趋化因子，对人和鼠组织中的成骨细胞有强烈的趋化作用. PDGF 是由血小板、巨噬细胞和骨细胞合成，贮存于骨基质中. 它在创伤愈合中起重要作用，称为“创伤因子”. 其主要功能是诱导成骨细胞和骨祖细胞分裂，对于培养的成骨细胞有强烈的趋化作用，能刺激胶原合成. Canalis等［24］发现: PDGF有与IGFⅠ同样的作用，能刺激鼠骨DNA及胶原合成，但是PDGF也具有促使胶原降解的性能.
　　2．7类胰岛素生长因子IGF家族由两种相关多肽组成，即IGFⅠ和IGFⅡ. 它们是骨基质中最富含的生长因子，两者有相似的结构和体外作用，但在体内生物学效应不同. IGFI 在细胞增殖及细胞外基质合成代谢中具有重要作用. Throp等［25］研究证实了IGFⅠ和TGFβ具有相互作用以促进细胞增殖、胶原及蛋白聚糖合成的作用.
　　IGFⅡ是重要的细胞内调节剂，能刺激骨细胞的增生、增加骨细胞的分化和I型胶原合成. Strong等［26］发现IGFⅡ能在正常人骨细胞培养中24 h 内增加原胶原mRNA 2～4 倍.
　　　
　　综上所述，细胞因子不过是众多因子中研究较为成熟的几个，如何把这些因子的作用应用于组织工程中，才是我们研究生长因子的目的. 什么样的方法才能使细胞因子的活性在组织工程中发挥最好的作用还要进一步探讨.

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