关于荧光偏振和多重聚合酶链技术在肺炎支原体、肺炎衣原体检测中的应用

　　　　　　　　　　 作者：姜怡　王玲　伍雪艳　闫小君　董秀珍　　

【摘要】 目的: 应用多重聚合酶链反应和荧光偏振检测技术建立一种方便可靠、简单经济的肺炎支原体、肺炎衣原体DNA同步检测方法. 方法: 以与肺炎衣原体、肺炎支原体16SRNA序列互补的特异、无交叉反应的两对引物在同一反应体系中行多重聚合酶链反应扩增阴阳性对照及521例患儿咽喉分泌物，将荧光偏振检测技术与模板指导的DNA末端延伸反应（TDI FP）结合，对样本PCR扩增产物进行进一步检测，并与测序方法结果比较. 结果: 应用多重聚合酶链反应和TDI FP技术检测患者521例，肺炎衣原体感染阳性121例，肺炎支原体感染阳性113例，与测序检测方法符合率100%，其中肺炎衣原体、肺炎支原体双重感染阳性10例. 结论: 建立了基于荧光偏振技术检测肺炎衣原体、肺炎支原体的新方法，具有良好的特异性，方便简单，无需标记探针，可用于临床检测.
【关键词】 肺炎衣原体；肺炎支原体；荧光偏振；多重聚合酶链反应
　　【Abstract】 AIM: To develop a simple，economical，accurate and practical method for the detection of Mycoplasma pneumoniae (MP) and Chlamydia pneumoniae (CP) using Templatedirected dyeterminator incorporation with fluorescence polarization （TDIFP） and a multiple PCR. METHODS: Twopair primers of MP and CP were used to amplify DNA of positive and negative controls and 521 samples by a multiple PCR， then the PCR products were identified by TDIFP：MP and CP specific probe hybridization and special fluorogenic label ddNTP incorporation. A fluorogenic ddNTP was directly added to the end of probe under the direction of template. The results were measured by a fluorescencepolarization microplate reader and compared with the results of sequencing. RESULTS: There were 113 patients infected with MP， 121 patients infected with CP， 10 with double infections. Compared with the results of sequencing， the results measured by TDIFP showed an excellent overall agreement when single infection was taken into account. The proposed method could detect single or multiple infection by a multiple PCR， but DNA sequencing method was limited. TDIFP method reached the detection level (10 copies) and the data of FP values showed excellent reproducibility. CONCLUSION: The proposed method allows a sensitive， special， simple and economical detection of MP and CP by a multiplePCR without any use of label probes. It is expected to be an extremely useful tool in clinic.
　　【Keywords】 Mycoplasma pneumoniae; Chlamydophila pneumoniae; fluorescenc polarization， multiple PCR
　　0引言
　　肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae， MP)和肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae， CP)是引发呼吸道感染的常见病因，患者的起始症状及胸部X线特征与其他病原体特别是SARS病毒引起的呼吸道感染极其相似而易误诊. 因此，及早快速准确地检测MP，CP感染，对鉴别诊断和预防控制相关疾病非常重要［1-2］. 我们采用荧光偏振检测与模板指导的末端延伸反应检测技术相结合（TDIFP）的方法，建立了在同一反应体系中应用多重引物，同步检测MP，CP感染的方法.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　标本采集于在第四军医大学唐都医院、西京医院、西安交通大学第二医院儿科的就诊患者521例，在24 h内未使用任何抗生素. 用无菌咽试子插入咽喉处旋转涂抹， 停留1 min后取出试子重悬于500 μL PBS中，置于-20℃备检. pGEMTEasy Vector System TA Cloning试剂盒(Promega Corporation公司)，BigDye Terminator Cycle Sequenceing试剂盒、ABI 377（美国AB公司），ddGTPR110/ddCTPTAMRA，核酸外切酶I、虾碱性磷酸酶、荧光偏振检测仪（美国Perkin Elmer公司）. 含CP，MP保守区基因质粒由本研究所提供. DNA引物及探针由上海博亚公司合成，据GenBank基因序列及引物合成原则选取CP(CP 16S ribosomal RNA)，MP(MP 16S ribosomal RNA)保守区序列设计各自特异、互不交叉的引物、探针及掺入碱基，扩增片段长度分别为160， 275 bp. CP：引物5′ tatttgacaactgtagaaatacagc 3′， 5′ ttagagttccccaccctaagtgctggc 3′，探针5′ cgcaaggacagatacacaggtgctgcatgg 3′，掺入碱基ddCTPTAMRA，MP：引物5′ aaaggacctgcaagggttcgttat 3′，5′ ctctagccattacctgctaaagtc 3′，探针5′ agtagaatagccacaatgggactgacac 3′，掺入碱基ddGTPR110.
　　1.2方法
　　1.2.1DNA的提取及多重PCR扩增将分泌物在500 μL PBS中反复震荡洗涤挤干，12 000 g离心2 min， 弃上清， 沉淀震荡重悬于200 μL PBS中， -20℃反复冻融3次， 煮沸， 12 000 g离心5 min， 留上清作模板. 取DNA模板5 μL，扩增靶片段DNA. 扩增条件：dNTP 150 μmol/L，引物各20 pmol/L，MgCl2 2.0 mmol/L. 94℃ 5 min变性， 94℃ 1 min，50℃ 2 min， 72℃ 5 min，30个循环. 含CP，MP16SRNA基因质粒DNA混合物为阳性对照，不含待测靶基因的同源质粒DNA为阴性对照.
　　1.2.2PCR扩增产物的分析采用CP，MP特异序列杂交与模板指导的末端碱基掺入延伸反应（TDIFP）对扩增产物分析. PCR产物与核酸外切酶I、虾碱性磷酸酶37℃孵育1 h，消化剩余的引物和dNTP，95℃ 15 min灭活酶活性. 然后以此产物为模板，分别以CP，MP特异探针及标记的ddGTPR110/ddCTPTAMRA为底物，在DNA聚合酶及其缓冲液中于95℃ 2 min， 95℃ 15 s，45℃ 30 s，25个循环，特异序列杂交并引导模板指导的末端碱基ddGTPR110/ddCTPTAMRA掺入延伸反应(图1)，分别于波长535，595 nm 检测R110，TAMRA掺入荧光偏振值（mp）.
　　1.2.3敏感性测定以10倍比例分别将CP，MP阳性对照的质粒倍比稀释直至10ag(1拷贝)，PCR扩增，产物进行TDIFP法分析判读.
　　1.2.4重复性测定分别对阴阳性对照及521例标本的荧光偏振值重复检测10次，观察FP变化.
　　1.2.5与测序方法对比应用试剂盒将随机抽取TDIFP检测CP，MP阳性各50例标本PCR产物连接至pGEMTEasy质粒载体中，测定插入片段的DNA序列，在NCBI BLAST2.0中确定所测序列，并与TDIFP方法检测结果比较.

　　统计学处理： 检测结果用SPSS 10.0软件经χ2检验.
　　2结果
　　2．1TDIFP法检测检测阴、阳性对照与标本DNA经2对引物扩增后，分别与CP，MP的特异探针及荧光标记碱基反应，分别检测R110，TAMRA荧光偏振值. 阴性对照无特异的杂交反应并ddGTPR110/ddCTPTAMRA掺入，TAMRA，R110值均未增高，CP，MP阳性对照分别与相应特异的探针发生杂交反应并ddGTPR110或ddCTPTAMRA掺入，R110或TAMRA值分别增高；TAMRA及R110值均增高， 则CP，MP双重阳性(表1). 521例标本中CP感染阳性121例，MP感染阳性113例，其中CP，MP双重感染阳性10例.表1对照与标本的R110，TAMRA荧光偏振值（略）
　　2.2敏感性测定对阳性对照质粒倍比稀释的PCR扩增产物进行的TDIFP分析表明，该法敏感度可达10拷贝.
2.3重复性测定在521例标本中，荧光偏振值检测10次的变化幅度小于10 mp，无统计学意义.
　　2.4与测序方法对比50例单纯CP，MP感染与测序方法符合率达98% (P&>0.05).
　　3讨论
　　CP，MP是引发急性呼吸、循环系统感染的主要病原体，在无实验室依据时临床难以与其他病原进行鉴别［3-4］. 传统的抗原检测易受到采样、运送、保存、用药及抗原交叉反应等多种因素的干扰. 基因诊断直接检测临床标本感染病原体的基因， 属病因诊断，在疾病预防、诊断及疗效考核等各方面都有重要意义［5］. 经典的采用琼脂糖凝胶电泳等手段对检测结果观察分析，人为误差大，假阳性、假阴性率高，实时荧光定量PCR检测技术需特异标记的探针，实验成本增加，价格昂贵［6］. 荧光偏振技术检测偏振光强度而非荧光强度，灵敏度高，快速、简单和准确. TDI反应是在DNA模板引导下的引物末端延伸反应，通过引物扩增、确定特异探针与靶DNA的识别杂交及在模扳指导下在特定位置特异硷基掺入三重把关，决定基因型，从而确保反应的特异性［7］.
　　 我们在一次PCR反应体系中加入2对高度特异、互不交叉的CP， MP引物，针对2个靶DNA进行扩增，再利用TDIFP基因检测技术，使用2个特异探针及特异末端终止碱基，对PCR产物鉴定，检测CP， MP，使得对感染的检测快速、可靠、特异及操作简单，尤其能降低多重混合感染的漏诊率和检测成本，提高了检验效率，与测序检测方法符合率高， 敏感度高达10拷贝，不失为高通量的、临床实验室实用的基因诊断新方法.

参考文献

　　［1］陈小友，贾土妹，陈黎勤. 肺炎衣原体和肺炎支原体MP感染与儿童哮喘的关系［J］. 浙江预防医学，2006， 18（10）：50-54.

　　［2］姚莹. SARS诊断的鉴别思考［J］. 中国误诊学杂志，2005，5(5)：959-960.

　　［3］Liu G， Talkington DF， Fields BS，et al. Chlamydia pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae in young children from China with communityacquired pneumonia［J］. Diagn Microbiol Infect Dis， 2005，52(1):7-14.

　　［4］Sinaniotis CA， Sinaniotis AC. Communityacquired pneumonia in children［J］. Curr Opin Pulm Med， 2005，11(3):218-225.

　　［5］Ginevra C， Barranger C， Ros A，et al.Development and evaluation of Chlamylege， a new commercial test allowing simultaneous detection and identification of Legionella， Chlamydophila pneumoniae， and Mycoplasma pneumoniae in clinical respiratory specimens by multiplex PCR［J］. J Clin Microbiol， 2005，43(7):3247-3254.

　　［6］Murdoch DR. Molecular genetic methods in the diagnosis of lower respiratory tract infections［J］. APMIS， 2004，112(1112):713-727.

　　［7］Hsu TM， Chen X， Duan S， et al. Universal SNP genotyping assay with fluorescence polarization detection［J］. Biotechniques， 2001，31(3):560-568.