关于辛伐他汀对卵巢切除大鼠股骨骨折愈合作用的影响

　　　　　　　　 作者：张柳　刘锋　梁春雨　赵文国　　

【摘要】 目的：研究辛伐他汀对卵巢切除大鼠股骨干骨折愈合的作用. 方法：50只雌性、12 wk龄SD大鼠共分成5组，每组10只大鼠. 分成假手术组（Sham，G1），双侧卵巢切除术组（OVX，G2），假手术+骨折+生理盐水组(Sham+F+V，G3)，卵巢切除术+骨折+生理盐水组(OVX+F+V，G4)，卵巢切除+骨折+辛伐他汀药物组（OVX+ F+SV，G5），所有需制造骨折的大鼠均采用右股骨中段横行骨折，髓内针固定；辛伐他汀给药组采用大鼠灌胃，隔日1次（5 mg/kg），于术后4 wk处死，取大鼠右侧股骨标本. 分别进行CR摄片、组织形态学染色，并应用双能X线骨密度仪（DEXA）测量右股骨整体骨密度(tBMD)、远段骨密度(dBMD)和中段骨密度(mBMD)以及BMP2免疫组化观察，并应用病理图像分析仪对BMP2免疫组化进行光密度测量. 结果：(1) OVX组与Sham组比较BMD下降. (2) OVX+F+V组与Sham+F+V组比较骨痂mBMD降低；骨痂组织存在大量软骨岛、软骨细胞发育不成熟，骨小梁发育不良，破骨细胞多见. BMP2的表达无统计学差异. (3) OVX+F+Sv组与OVX+F+V组比较:骨痂mBMD和BMP2的表达增高；积分光密度值显著增高，骨小梁较宽、排列整齐板层骨形成，软骨组织较少见. 结论：①骨质疏松不仅延缓骨折愈合过程，而且降低骨折愈合质量. 自软骨痂向骨性骨痂演变过程减缓. 对骨折愈合过程的影响与BMP2的表达无明显相关. ②辛伐他汀对OVX大鼠具有明显的促进骨形成，明显加快骨折愈合的作用，加速编织骨向板层骨的演变. 而且与BMP2的表达有显著相关性.
【关键词】 骨质疏松症；卵巢切除术；骨折愈合；他汀类药物；骨形态发生蛋白；免疫组织化学
　　【Abstract】 AIM: To evaluate the effects of simvastatin on femoral fracture healing in bilaterally ovariectomized rats. METHODS: Fifty 12weekold female SpragueDawley rats were pided randomly into 5 groups， with 10 in each group. They were shamoperated group （Sham）， bilaterally ovariectomized group （OVX）， shamoperated and femur fracture group （Sham+F+V）， bilaterally ovariectomized and femur fracture group （OVX+F+V）， bilaterally ovariectomized and femur fracture and administration of simvastatin group （OVX+F+Sv）. Simvastatin was administrated once per two days (5 mg/kg) for 4 weeks. Right femoral diaphysis was fractured transversely at the midshaft and fixed with intramedullary stainless wire. All rats were sacrificed at week 4 after operation. Right femora were removed for the observation of radiology and histology， and for the monitoring of bone mineral density (BMD) by dualenergy Xray absorptiometry（DEXA）， immunohistochemical assessment of BMP2 and Integral Optic Density （IOD）. RESULTS: The mean total BMD （tBMD） of the OVX group was significantly lower than that of the Sham group. The immunohistochemical results showed that there was no significant difference in the expression of BMP2 between the OVX+F+V and Sham+F+V groups in callus. But the mean middle BMD of the OVX+F+V group was significantly lower than that of the Sham +F+V group， and the cartilage islands in the OVX+F+V group was more than that of the Sham+F+V group; the hypertrophic chondrocytes were observed in the center of cartilage islands， trabecular bone became narrow and was arranged irregularly. The mean middle BMD and BMP2 level of the OVX+F+SV group was significantly higher than these of the OVX+F+V group. The mean IOD of the OVX+F+Sv group was significantly higher than that of the OVX+F+V group; the woven bones were remodeled into lamellar bones and cartilage islands was not observed. CONCLUSION: (1) Osteoporosis inflences the quantity and quality of fracture callus during the early period of fracture healing and reduces the mineralization of soft callus. The failure of the osteoporotic rats to heal promptly is not due to the lack of BMP2 expression. (2) Simvastatin increases bone formation and greatly promotes the fracture healing from woven bones to lamellar bones in ovariectomzied rats.
　　【Keywords】 osteoporosis; ovariectomy; fracture healing;statins; bone morphogenetic proteins; immunohistochemistry
　　0引言
　　他汀类药物是目前临床用于降低胆固醇、预防心血管疾病的常用药物，其作用机制是抑制羟甲基戊二酰辅酶A还原酶，从而降低肝脏胆固醇的合成. Mundy等［1］的研究首次表明，他汀类药物具有激活成骨细胞、促进骨合成代谢作用. 这一发现为临床治疗和预防骨质疏松症提供了新的研究思路和方向. 我们通过建立大鼠骨质疏松(OP)［2］和骨折(F) ［3］的模型，进一步研究该药对对雌激素缺乏导致的骨质疏松性骨折愈合的影响及其作用机制.
　　1材料和方法
　　1．1动物模型制备与分组
　　健康12 wk龄雌性SD大鼠50只（北京大学医学部实验动物中心），普通级，质量(258±14) g. 将受试大鼠随机分成5组，即A组：假手术组（Sham），B组：卵巢切除术组（OVX），C组：假手术+骨折+生理盐水组(Sham+F+V)，D组：卵巢切除术+骨折+生理盐水组(OVX+F+V)，E组：卵巢切除+骨折+辛伐他汀药物组（OVX+F+Sv），每组10只大鼠.
　　OVX的制备：所有动物模型制备的麻醉方法均采用10 g/L戊巴比妥钠以40 mg/kg体质量的剂量腹腔注射麻醉. 采用背侧入路，常规去毛，碘伏消毒后，以后方髂骨嵴上2 cm， 脊柱旁1 cm处取纵行切口，长约1 cm，依次切开皮肤，皮下和肌层，暴露腹腔，卵巢切除后，以丝线将残端结扎，逐层关闭伤口.
　　骨折模型（F）制备：行右大腿中段外侧纵形皮肤切口，长约2 cm，沿股外侧肌间隙钝性分离进入达股骨干，固定股骨，在股骨干中1/3段用线锯锯断成横行骨折，此过程注意保护坐骨神经和肌肉组织，再以直径约1.5 mm的克氏针逆行穿入骨折近端且从后侧股骨大粗隆穿出，复位骨折后再将其顺行穿入骨折远段髓腔，生理盐水冲洗，逐层关闭伤口.
　　将辛伐他汀片（成都华宇制药有限公司，批号：国药准字19990002）置入研钵内研成粉末，再用双蒸水溶解成悬浊液，以灌胃针灌胃（5 mg/kg），隔日1次，共4 wk. 分别将受试大鼠采用10 g/L戊巴比妥钠以40 mg/kg体质量的剂量腹腔注射麻醉，于术后4 wk心脏取血处死，取大鼠右侧完整的股骨标本，并置100 g/L中性甲醛液4℃冰箱保存.
　　1.2观察指标
　　1.2.1CR摄片将大鼠完整的右侧股骨干骨折标本经计算机X线摄相仪（CR）摄片（距离：90 cm， 电压：40 Kvp， 电流：3.2 mA·S），观察大鼠股骨骨折骨痂的连续性及骨折愈合情况.
　　1.2.2骨密度测定应用NorlandXR36双能X线骨密度测量仪（DEXA，美国），采用小物体扫描模式（准确度0.01%，扫描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，扫描宽度5.0 cm）进行测量. 测量时，拔除克氏针，将股骨全长三等分，分别测股骨全长、远1/3段、中1/3段（感性趣区）. 精确度用变异系数（CV）表示，测得股骨不同部位变异系数为： 全长0.47%，远段0.51%，中段0.41%.
　　1.2.3骨痂形态学染色将大鼠股骨骨折标本，置入100 g/L中性甲醛缓冲固定液中（pH=7.2～7.4），在4℃条件下固定24～48 h，再经10%EDTA2Na缓冲液（pH=7.4，4℃）脱钙，隔5～7 d更换脱钙液，经过3～5 wk后，经鉴定，脱钙完全，然后，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，纵向石蜡包埋，5 μm连续切片，HE染色，透明后中性树胶封片，Olympus显微镜下作普通光镜观察.
　　1.2.4免疫组化染色并图像分析采用SABC法，BMP2 SABC免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司. 具体操作严格按说明书进行，以该公司提供的阳性片作为阳性对照，用PBS液替代一抗作为阴性对照. 采用HPAIS1000高清晰度彩色病理图像分析系统，将免疫组化标本切片经显微镜输入计算机图像分析系统，并对图像进行二值分割，然后随机选取4个视野，在光镜10×10倍视野下，在同一阈值把所有样品全部测完，取骨痂组织阳性细胞平均积分光密度做为统计指标.
　　
　　统计学处理：将实验数据资料用SPSS 12.0来处理，各组数据经过ShapiroWilk正态性检验和Bartlett方差齐次检验后，利用单因素方差分析（ANOVA）及LSDt检验比较组间差异. 计量数据采用x±s表示，以P&<0.05表示具有统计学意义.
　　2结果
　　2．1绝经后骨质疏松模型的建立OVX组大鼠体质量从第3 wk增加高于Sham组（P&<0.05，表1）；术后4 wk测量OVX组与Sham组大鼠离体股骨远1/3段、中1/3 段及整体骨密度（表2），显示OVX组股骨骨密度值下降（P&<0.05）.表1卵巢切除术后大鼠体质量变化(略)
　　2.2CR摄片的观察各骨折组大鼠骨折端均未发现不愈合现象. OVX+F+V与Sham+F+V组比较：Sham+F+V大鼠骨折端大部分骨性愈合，有连续性骨痂包绕，但OVX+F+V骨痂量较少，骨折线清晰，发现部分内固定克氏针松动和脱落现象. OVX+F+Sv与OVX+F+V组比较：大鼠的骨性愈合较好，骨痂量相对较少，骨折线较模糊，内固定克氏针无松动和移位，无畸形愈合及成角.
　　2.3各实验组大鼠骨密度测量大鼠右侧股骨分别测量全长(tBMD)， 远1/3段(dBMD)， 中1/3段(mBMD)的骨密度（中段包括了骨折部位及全部骨痂），测得结果见表2，3.表2假手术组与卵巢切除术组股骨不同部位骨密度测量值(略)表3各骨折组股骨不同部位骨密度的测量值(略)
　　2.4骨痂组织形态学观察OVX+F+V与Sham+F+V比较：后者骨痂中，软骨细胞成分已经较少，代之以较为成熟的小梁骨，更无“软骨岛”细胞团，破骨细胞少见，骨小梁成熟度高，骨小梁宽，钙盐沉积，编织骨形成并向板层骨转变. 而前者骨痂中仍然存在较对照组更多的软骨细胞，有的甚至仍可以见到“软骨岛”存在，软骨细胞发育迟缓且可见到破骨细胞功能活跃，形成骨吸收陷窝，并与成骨细胞相“耦合”，使原始骨小梁不断改建成为成熟骨小梁，但是，由于小梁状骨吸收快，骨小梁粗细不均匀，小梁间距明显增宽. 表明骨折愈合过程中软骨性骨痂向骨性骨痂转化较对照组缓慢. OVX+F+Sv与OVX+F+V比较：骨痂中骨性骨痂较多，软骨骨痂少见或基本消失，小梁骨成熟度较高，成骨细胞功能活跃，破骨细胞少见，软骨细胞较少，但未见到“软骨岛”存在. 骨小梁粗细均匀一致，间距无明显增宽，板层骨形成. 表明骨折愈合过程中软骨性骨痂向骨性骨痂转化加速.
　　2.5免疫组化BMP主要沉积在功能活跃的成骨细胞及其周围和产生骨小梁的边缘，纤维骨痂中较少，Sham+F+V组(37.2±12.2)与OVX+F+V组(27.52±12.3)均有阳性细胞表达，二者差异无统计学意义（P&>0.05），而OVX+F+SV(87.9±26.9)阳性细胞表达较强，所测IOD值与OVX+F+V比较有统计学差异（P&<0.05）.
　　3讨论
　　卵巢切除大鼠是模拟绝经后骨质疏松症的公认模型. Wronski等［4］研究发现成年大鼠卵巢切除后，与人类绝经后骨质疏松症相似. 本研究发现OVX大鼠体重自术后第3周开始呈现统计学上的显著性增加，离体股骨的骨密度测量值显著下降（P&<0.05）. 此外，采用开放骨折方法可以保证骨折类型的统一和所得实验数据的可比性［5-6］.
　　有研究表明，双侧卵巢切除术后骨折的愈合过程有所延缓，骨痂形成量减少，生物力学性能降低，骨折愈合的质量和强度较差［7-9］. Ernst等［10-11］也发现，雌激素在骨折愈合过程中的细胞分化和基质合成方面发挥着重要的局部调节作用，可直接影响到骨痂基质的形成和质量.
　　本实验在大鼠术后4 wk杀死取材，该时间位于软骨骨痂消失、编织骨向板层骨转化的时期［12］. OVX+F+V组骨痂量减少，软骨骨痂比例高，骨痂BMD明显降低，表明骨折愈合过程中软骨骨痂向骨性骨痂转化延迟，小梁骨吸收加快，骨形成降低，最终导致骨痂骨密度和骨量显著减少，因此，骨质疏松不仅可以导致骨折愈合缓慢，而且引起骨折愈合的质量下降.
　　
　　BMP2具有募集间充质细胞并诱导其向成骨细胞或成软骨细胞分化；协同其他调节因子参与骨组织形成［13］. 本研究发现，OVX+F+V组与Sham+F+V组BMP2的表达无显著性差异，是因为BMP2等生长因子约释放4 wk［14］，在此期间Sham+F+V组已基本完成软骨内成骨，而OVX+F+V组仍处于软骨内成骨阶段，低浓度的BMP2无法对软骨基质的钙化起诱导作用，从而进一步延缓了成骨过程.
　　Mundy等［1］经动物实验筛选了3万多种天然或人工化合物，首次发现他汀类药物是所选药物中唯一具有激活成骨细胞、促进骨合成代谢作用的药物，认为他汀类药物通过刺激成骨细胞增加特异性荧光素酶的活性，而这种荧光素酶活性的增加可被HMGCoA还原酶的下游代谢产物提供外源性甲羟戊酸所阻断，提示了对骨形成的作用与此酶的抑制有关. Sugiyama等［15］建立含5′人骨形态发生蛋白（BMP2）启动因子基因部分，并将其转入人的骨肉瘤细胞经克隆培养，向培养液中加入simvastatin，利用虫荧光素酶作媒介体进行检测发现，
simvastatin可以明显增加BMP2启动因子数量，从而激发成骨细胞合成BMP2，而认为其对骨组织的作用是通过BMP2的介导促进骨生成. 他将他汀药加入小鼠（2T3）和人（MG63）成骨细胞培养液中，经印迹分析显示出BMP2 mRNA的表达水平明显提高，同期阳性对照的rhFGF1， rhBMP2也证实对BMP2的表达呈特异性，但它并不能增加BMP4， IL6， PTH及相关多肽的表达. 经2.5 μmol/L simvastatin处理的人类MG63成骨细胞株培养上清液中，BMP2的产量增加了2.7倍. 而BMP2为公认的成骨细胞转化促进因子，同时，他汀药作用与直接加入BMP2的结果相似，故该学说是目前较为公认的他汀类药物刺激骨形成的理论. 他汀药物能促进新生小鼠颅盖骨培养的成骨细胞数量与新骨生成量，而在活体实验也证实了这一结果［16］.
　　
　　目前，认为他汀类药物具有促进骨形成的作用机制主要是通过增加BMP2启动因子的数量，促进成骨细胞合成BMP2，而BMP2是公认的成骨细胞转化促进因子. 部分临床流行病学观察到，他汀类药物具有骨保护作用，可降低骨折的危险性［17-20］.

　　本研究发现，OVX+F+Sv组CR片显示骨折端骨折线较模糊，骨痂量增加，骨痂BMD明显升高，镜下编织骨已转化为板层骨，骨小梁成熟度高，排列规整，其骨痂中BMP2的表达显著高于对照组，表明辛伐他汀通过促进BMP2表达，不仅可以显著增加骨折愈合的数量和质量， 而且加速骨折愈合的速度， 缩短骨折愈合时间. 这为寻找用于临床治疗和预防骨质疏松性骨折的他汀类药物或拟似物提供了实验依据.

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