关于益母草对糖尿病肾病大鼠血液流变学及转化生长因子 β1表达的影响

　　　　　　　　 作者：王辉，陈清江，杨再刚，张冰，苗明三

　　【Abstract】 AIM: To observe the effects of Leonurs Heterophyllus Sweet (LHS) on blood rheology and transforming growth factorβ1 (TGFβ1) in rats with diabetic nephropathy. METHODS: A total of 48 SD rats were randomly pided into 4 group: normal control group， model group， LHS treated group and Radix Astragali treated group. The latter 2 groups were given 5 g/(kg·d) LHS or Radix Astragali extract， and the first 2 groups were administered samevolume normal saline. Diabetic nephropathy models were induced by injecting streptozotocin (STZ) in 0.1 mmol/L buffer (pH 4.4)， and fed highlipid， highglucose diets. Two weeks later， the animals with fasting blood glucose level of over 16.65 mmol/L were selected as models. Their body mass was weighed at modeling and sacrifice， and the kidneys were taken for weighing， pided into two parts， half for refrigeration at -80℃ and half for fixing in formalin. 24 h urine was collected as well. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of TGFβ1 in nephridial tissue and blood rheometer was employed to determine the change of blood rheology. CONCLUSION: Leonurs Heterophyllus Sweet had a protective effect on diabetic nephropathy， which may be related to its improving the index of blood rheology.
　　【Keywords】 eonurus; Hemorheology; transforming growth factorbeta1
　　【摘要】 目的：观察益母草对糖尿病肾病大鼠血液流变学及转化生长因子β1的影响. 方法: 取健康SD大鼠48只. 随机均匀分为正常组、模型组、益母草组、黄芪组4组. 益母草组、黄芪组分别灌服5 g/(kg·d)益母草、黄芪水煎液，正常对照组、模型对照组灌服相同体积生理盐水. 造模前禁食12 h. 将链脲佐菌素(STZ)用0.1 mmol/L， pH为4.4的枸椽酸缓冲液配成1%的浓度，以50 mg/kg的剂量一次性腹腔注射，同时喂养高脂高糖半合成高热量饲料，2 wk后测定空腹血糖，血糖值超过16.65 mmol/L者，确定为模型成功. 所有大鼠均自由饮食，分别于造模和杀检时测量体质量，并于杀检时称量肾质量，用代谢笼收集24 h尿液. 实验8 wk后，大鼠在戊巴比妥钠麻醉下，腹主动脉取血并灌洗肾脏，将肾脏分为两部分，一部分于-80℃冰箱保存，另一部分用中性福尔马林固定. 运用免疫组化法及血液流变仪分别观察益母草对糖尿病肾病大鼠转化生长因子β1的表达及血液流变学的影响. 结果：益母草水煎液对糖尿病肾病大鼠肾组织中TGFβ1蛋白表达有下调趋势，但无统计学意义(P&>0.05)，而对其血流变学指标具有明显改善作用. 结论: 益母草对糖尿病肾病防治作用可能与其改善血流变学指标有关.
　　【关键词】 益母草属；血液流变学；转化生长因子β1
　　0引言
　　糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病常见的慢性严重并发症，它直接威胁着人类生命和生存质量，在世界范围内已成为糖尿病的主要死因. 目前，仍缺乏根治糖尿病肾病的理想药物，因此，运用药物对糖尿病肾病进行早期干预，以阻止或延缓糖尿病(diabetes mellitus，DM)发生肾脏病并发症或对已经出现DN延缓其发展至终末期肾病(endstage renal disease，ESRD)，达到“既病防变”目的. 临床上益母草常用于糖尿病慢性并发症的防治，药理研究表明益母草具有抗凝、降脂、抑制血小板聚集等作用［1-2］，但对其用于防治糖尿病肾病机制研究尚未见深入报道. 我们以链脲佐菌素(STZ)所致糖尿肾病大鼠为实验对象，观察益母草对糖尿病肾病血流变学及转化生长因子β1的影响.
　　1材料和方法
　　1.1材料STZ，Sigma公司产品；葡萄糖测定试剂盒:浙江东殴生物有限公司，批号041001. 即用型SABC免疫组化染色试剂盒购自武汉博士德生物工程公司. PBS(0.01 mol/L， pH 7.2~7.4)， 浓缩型DAB试剂盒和抗体稀释液均为北京中杉金桥生物技术有限公司产品. 752分光光度计，上海第三分析仪器厂. UV2000分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司. 血液流变仪:北京普利生仪器中心. 普通光学显微镜，日本Olympus公司. 益母草水煎液：原药材由河南省药材公司提供，经河南中医学院中药鉴定教研室鉴定益母草为唇形科植物益母草（Leonurs heterophyllus Sweet），按药典方法［3］炮制后. 称取益母草（切成段的干燥品）250 g，浸泡1 h，加水至2000 mL，煮沸60 min，双层纱布过滤. 二煎加水1000 mL，煮沸60 min，双层纱布过滤. 合并滤液，浓缩至250 mL（相当于每1 mL含生药1 g）放至冰箱4℃冷藏备用. 黄芪水煎液：原药材由河南省药材公司提供，经河南中医学院中药鉴定教研室鉴定为豆科植物蒙古黄（Astragalus memeranaceus）的根，按药典方法［3］炮制后. 称取黄芪（切成片的干燥品）250 g，浸泡1 h，加水至2000 mL，煮沸60 min，双层纱布过滤. 二煎加水1000 mL，煮沸60 min，双层纱布过滤. 合并滤液，浓缩至250 mL（相当于每1 mL含生药1 g）放至冰箱4℃冷藏备用.
　　1．2方法
　　1．2．1动物分组取健康SD大鼠48只，体质量180～220 g， 购自河南省实验动物中心. 随机等分为4组：正常组、模型组、益母草组、黄芪组.
　　1．2．2给药益母草、黄芪临床用量为15 g［3］，大鼠每千克1 d灌服生药量为15／60×20（倍）=5 g/(kg·d). 益母草组、黄芪组分别灌服5 g/(kg·d)益母草、黄芪水煎液，正常对照组、模型对照组灌服相同体积生理盐水.
　　1．2．3造模［4］造模前禁食12 h. 将STZ用0.1 mmol/L， pH为4.4的枸椽酸缓冲液配成1%的浓度，以50 mg/kg的剂量一次性腹腔注射，同时喂养高脂高糖半合成高热量饲料，2 wk后测定空腹血糖，血糖值超过16.65 mmol/L者，确定为模型成功. 所有大鼠均自由饮食，分别于造模和杀检时测体质量，并于杀检时称肾质量，用代谢笼收集24 h尿液.
　　1．2．4取材实验8 wk后，除空白组动物死亡2只，模型组、黄芪组分别死亡5只，益母草组死亡4只外，其余大鼠均在戊巴比妥钠麻醉下，腹主动脉取血并灌洗肾脏，将肾脏分为两部分，一部分于-80℃冰箱保存，另一部分用中性福尔马林固定.
　　1．2．5观察指标①于37℃条件下测定血液流变学部分指标:全血黏度，红细胞沉降率，纤维蛋白原，红细胞聚集指数，其中红细胞聚集指数利用有关公式计算；②采用免疫组化方法检测肾组织TGFβ1相对含量，即石蜡切片，经二甲苯、梯度乙醇脱蜡水化后，用 PBS（pH 7.4）；切片滴加50 μL 30 mL/L的过氧化氢去离子水，室温下孵育10 min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗 3×5 min；将切片放入盛有抗原修复液（柠檬酸缓冲液，0.01 mol/L，pH 6.0）的耐热容器内，于微波炉内加热煮沸后断电，反复3～5次，进行抗原修复，室温冷却，PBS 冲洗 3×5 min；滴加100 mL/L山羊血清工作液，室温孵育15 min，倾去，勿洗；滴加TGFβ1抗体（1∶100稀释），4℃过夜，PBS冲洗3×5 min；滴加生物素标记的二抗，室温孵育20 min，PBS 冲洗3×5 min；滴加试剂SABC，室温下孵育 20 min，PBS 冲洗4×5 min；滴加现配制的 DAB 显色液，室温显色10 min；自来水冲洗，苏木素复染，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片. 在日本Olympus BX60型显微镜图像采集系统下，采用MetaMorph图像分析系统，测量肾小球中着色的阳性物质面积及整个肾小球的面积，以二者比值表示所含成分在肾小球中的相对含量.

统计学处理：实验数据以x±s表示，采用SPSS11.0统计软件进行单因素方差分析及Dunnettt两两比较.
　　2结果
　　2．1对血液流变学影响全血高切黏度益母草组、黄芪组均显著改善，与模型组比较，差异具有统计学意义(P&<0.01)；全血低切黏度益母草组与模型组存在统计学差异(P&<0.01)，但与其它组比较，无统计学差异(P&>0.05)；红细胞聚集指数益母草组与模型组比较存在极显著性差异(P&<0.01)；益母草组、黄芪组与模型组比较，纤维蛋白原含量变化均存在统计学差异(P&<0.01，表1).
　　表1各大鼠血液流变学的变（略）
　　aP&<0.05， bP&<0.01 vs模型.
　　2．2各组大鼠肾脏 TGFβ1蛋白的表达TGFβ1阳性物质为棕黄色. 正常组TGFβ1有极微弱的表达，在肾间质的分布较肾小球内多. 模型组可见到TGFβ1大量分布在肾小球的毛细血管基底膜、血管内皮细胞，在肾间质的分布亦明显增多. 益母草组TGFβ1在肾小球的分布较模型组相比有减少趋势，但无统计学意义(P&>0.05)，而黄芪组TGFβ1在肾小球的分布较模型组相比明显减少(P&<0.05，表2). 说明黄芪能够减少早期DN大鼠肾组织中TGFβ1的表达，优于益母草组.
　　表2各组大鼠肾脏TGFβ1蛋白的表达情况（略）
　　aP&<0.05 vs模型.
　　3讨论
　　近年来国内外研究表明，糖尿病肾病发病机制是多因素的，主要有血流动力学的改变，蛋白非酶糖化，多元醇通道活性增加，蛋白激酶C通路异常等方面. 　
　　血流动力学改变在糖尿病肾病的发病中起关键作用，甚至是始动因素. 早期糖尿病肾病突出表现为肾小球高滤过、肥大和间断性尿白蛋白排泄率增加［5］. 血液流变学改变是糖尿病时微循环障碍的主要表现，在糖尿病微血管并发症的发展过程中起重要作用，甚至在微血管并发症出现之前就已存在而促进并发症的发生. 糖尿病时血液流变学改变主要表现为血液呈高凝状态、血液流速减慢和微血栓形成.
　
　　细胞因子在糖尿病肾病发病过程中也起重要作用. 在人类，TGFβ有3种异构体，即β1， β2， β3，肾脏中以TGFβ1为主，糖尿病时TGFβ及其受体mRNA上调. TGFβ1在糖尿病肾病发病过程中可以引起肾脏肥大［6］，抑制细胞外基质降解酶合成及其活性，使细胞外基质成分升高.
　　中医认为益母草具有活血调经，利水消肿，清热解毒之功效. 现代临床常于复方中用于防治糖尿病慢性并发症及肾病水肿. 本研究表明益母草水煎液对糖尿病肾病大鼠肾组织中TGFβ1蛋白表达无明显调节作用，但对其血流变学指标具有明显改善作用. 由于益母草又具有一定利尿作用，因此我们认为益母草水煎液对糖尿病肾病防治机制可能与其改善血流变及利尿等作用密切相关.

参考文献

　　［1］ 范美华，王健鑫，李鹏，等.益母草的研究进展［J］.中国药物与临床，2006， 6(7):528-529.

　　［2］ 徐勇，智光，郑思新. 益母草的心血管药理作用及临床应用［J］.世界急危重病医学杂志，2006，3(3):1312-1314.

　　［3］ 国家药典编写委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：化学工业出版社，2000:203.

　　［4］ 李伟，张红，殷松楼，等. 不同剂量链脲佐菌素诱导SD大鼠糖尿病肾病模型的研究［J］.徐州医学院学报， 2006， 26(1): 52-54.

　　［5］ 袁申元.糖尿病微血管并发症防治的临床及实验研究［J］.微循环学杂志， 2000， 10 (4): 11-12.

　　［6］ Shankland SJ， Scholey JW， LY H， et al. Expression of transforming growth factorbeta1 during diabetic renal hypertrophy［J］.Kidney Int，1994，46(2):430-442.