关于中低温度热疗诱导骨肉瘤细胞株凋亡

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　　　　　　　　　　 作者：单乐群，裘秀春，马保安，周勇，王育才，张殿忠，范清宇

　　【Abstract】 AIM: To observe the apoptosis of the osteosarcoma cells (OS9901) induced by hyperthermia and to explore the possible mechanism for mild temperature treatment of osteosarcoma. METHODS: The osteosarcoma OS9901 cells were treated with different temperatures for 1 h. The cell apoptosis was analyzed with electron microscope， TUNEL staining and counting. The Bcl2 protein expression in the OS9901 cells was also observed before and after hyperthermia (43℃， 1 h) using the immunohistochemical technology. RESULTS: A great number of abnormal osteosarcoma cells were observed at 6 h after 43℃ treatment for 1 h. Transmission electron microscopy demonstrated typical apoptosis morphological features of the cells， including size reduction， chromatin condensation， and apoptotic bodies appearance. The highest apoptosis rate reached 42% analyzed by TUNEL staining . The immunohistochemistry showed that the expression of Bcl2 decreased after treatment with 43℃ for 1 h. CONCLUSION: 43℃ treatment for 1 h induces apoptosis of osteosarcoma cells. Hyperthermia decreases the Bcl2 protein expression in the osteosarcoma cells， so as to induce the apoptosis of the cells .This study provides some theoretical basis for the mechanism underlying the apoptosis of tumor cells induces by thermotherapy.
　　【Keywords】 hyperthermia， induced; osteosarcoma; apoptosis; ultrastructure; immunohistochemistry
　　【摘要】 目的： 研究加热诱导成骨肉瘤细胞株(OS9901)凋亡，为中低温度热疗辅助成骨肉瘤综合治疗提供理论依据. 方法： 成骨肉瘤OS9901细胞株分别经不同温度的热疗作用1 h，用TUNEL法染色及计数、透射电子显微镜观察其对骨肉瘤细胞株的诱导凋亡作用. 同时通过免疫组织化学染色，观察43℃ 1 h热疗对成骨肉瘤细胞株OS9901的Bcl2蛋白表达的影响. 结果： 43℃作用1 h的成骨肉瘤细胞株继续培养6 h后出现大量异常细胞，透射电镜观察可见有典型的细胞凋亡特征性形态改变. TUNEL法染色后通过计数可见有42％的细胞凋亡比例. 免疫组织化学显示，43℃作用1 h的成骨肉瘤细胞株6 h后Bcl2蛋白的表达明显减少. 结论： 43℃作用1 h可以诱导成骨肉瘤细胞株OS9901凋亡. 加热后成骨肉瘤细胞Bcl2表达减少，从而进一步诱导发生细胞凋亡，为热疗诱导肿瘤细胞凋亡的机制提供了部分理论依据.
　　【关键词】 高温，诱发；骨肉瘤；细胞凋亡；超微结构；免疫组织化学
　　0引言
　　
　　骨肉瘤好发于青少年，早期易发生肺部转移，常危及患者生命. 由于其发病机制以及病因学仍然未知，临床治疗上还有很多难点. 1962年Crile的实验和临床研究奠定了高热治疗恶性肿瘤的生物学基础. 特别是20世纪80年代以来，用高温的方法治疗骨肿瘤已取得初步疗效［1］，热疗也就被认为是继手术、化疗、放疗及免疫疗法之后的又一大疗法. 我们就中低温诱导骨肉瘤细胞凋亡及相关作用机制进行研究，为热疗辅助骨肉瘤治疗的临床应用提供实验依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所自建的人成骨肉瘤细胞株OS9901［2］. RPMI1640， 胰酶购自Gibco公司，新生小牛血清购自杭州四季青生物制品厂. 恒温水浴加热器：Polystat 86633型，水温±0.1℃. TUNEL试剂盒购自Boehringer Mannheim公司. bcl2多克隆抗体购自美国Santa Cruz生物技术公司. 免疫组织化学试剂盒、DAB显色试剂盒均购自华美公司. 电子显微镜为日本GEM2000EX公司产品.
　　1.2方法
　　1.2.1细胞培养骨肉瘤OS9901细胞株常规以单层细胞贴壁培养于含100 g/L小牛血清的RPMI1640培养液中（含青霉素1×105 U/L，链霉素100 mg/L，以0.6 mol/L碳酸氢钠溶液调PH值至7.0左右），置于37℃，CO2恒温孵育箱，3 d传代1次.
　　1.2.2分组根据细胞株在不同温度条件加热1 h，分别设置40℃，43℃，46℃和37℃对照组，细胞经加热处理后，用Hank氏液洗涤2遍，再用RPMI1640培养液洗涤1遍后继续放置37℃，CO2恒温孵育箱培养6 h.
　　1.2.3加热方法将处于对数生长期的OS9901细胞株消化后分装入离心管，恒温条件采用电热恒温水浴箱加热（温度波动＜±0.1℃），将盛有细胞悬液的离心管置于水浴箱中加温(距液面4 cm处). 为保证温度准确并去除升温时差， 将温度计置于含相同体积培养液的离心管内， 于同一水平面测温， 当达到指定温度时开始记时， 加温时间为1 h.
　　1.2.4透射电镜检查分别取不同温度组的细胞悬液离心后弃去上清，加入4℃预冷2 g/L的戊二醛4 mL，4℃固定30 min，送电镜室脱水包埋后制成超薄切片，透射电镜下观察照相.
　　1.2.5TUNEL法检测细胞凋亡按照TdTFragELTM. DNA Fragmentation Detection kit说明进行操作.
　　1.2.6计数TUNEL阳性凋亡细胞百分率单盲法手工计数20个不同视野（400倍显微镜）下TUNEL阳性细胞及正常细胞，计算凋亡细胞百分率.
　　1.2.7免疫组织化学染色不同取样时间取出细胞悬液进行甩片，950 mL/L乙醇乙醚等量固定液固定至少15 min，用SABC试剂盒进行bcl2染色，过程按照试剂盒说明操作，设立空白对照. 无阳性反应细胞且背景同空白对照者为阴性(-)，标本阳性细胞率低于30％为(+)，标本阳性细胞率介于30％~60%之间者为()，标本阳性细胞率高于60％为().
　　2结果
　　2.1形态学观察骨肉瘤细胞凋亡透射电镜观察显示43℃热疗1 h可以诱导OS9901细胞株凋亡，在电子显微镜下表现出典型的细胞凋亡特征性变化：细胞皱缩、胞膜结构保持完整、胞浆空泡化明显、胞核固缩、染色体浓缩并边缘化，表现为核碎裂(图1).
　　2.2TUNEL染色及计数对加热处理的细胞进行TUNEL染色、DAB显色及甲基绿衬染. 结果显示，TUNEL染色呈阳性的细胞，细胞核呈棕色，提示细胞已经凋亡（图2）；而对照组细胞则呈现蓝绿色. 单盲法手工计数20个不同视野（400倍显微镜）下TUNEL阳性细胞及正常细胞. 结果显示，加热43℃ 1 h组TUNEL阳性凋亡细胞百分率增加，最大为42％；正常温度37℃ 1 h组TUNEL阳性凋亡细胞百分率为2％，加热40℃及46℃ 1 h组TUNEL阳性凋亡细胞百分率分别为16%及6％.
　　A： 未加热正常细胞×5000；B：加热×7500.
　　图1透射电镜观察43℃ 1 h热疗骨肉瘤细胞株出现明显的凋亡，可见胞核固缩、染色体浓缩并边缘化，表现为核碎裂（略）
　　A: TUNEL染色阴性；B: TUNEL染色阳性.
　　图2骨肉瘤细胞株加热43℃1 h细胞凋亡的TUNEL检测×200（略）
　　2.3免疫组织化学染色OS9901细胞株43℃加热1 h后的Bcl2免疫组织化学染色提示：Bcl2蛋白的表达在加热后继续孵化6 h以上较对照组明显减少，由加热前的变为加热后的±（图3），说明中低温度热疗后Bcl2蛋白的表达明显减少.
　　3讨论
　　
　　骨肉瘤是骨最常见的原发性恶性肿瘤，其发病率占恶性骨肿瘤的21％. 常常发生于青少年，5 a生存率为20%~79％，致死的主要原因是发生肺部转移，约有10%~20％的患者在就诊时就已有肺部转移. 探讨有效的治疗方法已成为骨肉瘤研究的重要方向.
　　A: 加热前；B: 加热后.
　　图3骨肉瘤细胞株加热前后Bcl2蛋白的表达×400（略）
　　加热对肿瘤的治疗早在5000多年前的古埃及医书中就有描述. 近20 a来利用加热的方法治疗肿瘤，已显示出一定的优势［3］，如何选择一个合适的温度和时间是加热抗肿瘤治疗的关键性问题. 有许多实验进行了这方面的研究，在敏感的组织中，加热43℃ 30 min可以引起广泛的细胞凋亡，而加热到46℃或更高则会产生坏死，且不同的肿瘤对于高温的反应差别很大［4］. 1973年Giovaneva等［5］发现C57B1小鼠肉瘤细胞加热到42.5℃，2 h后95％灭活，而正常组织仅有43％死亡，提示恶性肿瘤常伴有耐热性的下降，中低温对正常组织影响较小，其机制尚未完全明了［6］.

　　细胞凋亡是细胞的程序化死亡，是多细胞有机物的调控机体发育，维系内环境稳定的一种细胞主动死亡过程. 生理和病理条件下组织中均有凋亡的发生，其在组织生长中扮演着一个重要的角色［7］；凋亡与肿瘤的发生、发展也有着很大关系. 正常情况下细胞的增殖和凋亡维持着组织中的细胞动态平衡，研究肿瘤的凋亡活动，可以为肿瘤的预后判断提供新的线索. 诱导肿瘤细胞凋亡，并最小限度的影响周围正常组织，对于肿瘤的治疗有着重要的意义. 治疗性的刺激因素如细胞毒性药物和放射线照射均可诱导肿瘤细胞发生凋亡，热疗也可以诱导肿瘤细胞发生凋亡［8］.
　　
　　本实验中加热43℃1 h组诱导骨肉瘤细胞凋亡的百分率最高，约为42％. 40℃1 h组及46℃ 1 h组凋亡细胞率均低于此，可能是由于40℃ 1 h热疗尚不足于引起大量骨肉瘤细胞发生凋亡，而46℃1 h的处理可引起大量肿瘤细胞坏死. bcl2基因是细胞凋亡调控中最重要的基因之一，其相关蛋白是一个相对分子质量为25 000的膜结合蛋白，Bcl2可以通过抑制细胞凋亡来阻碍或延迟正常细胞的分化，从而延长细胞的寿命，使细胞数目增多，增加了基因变异机会，有助于肿瘤的发生. Bcl2过度表达可明显降低放射线、化疗药物等引起的细胞凋亡. Bcl2蛋白在人骨肉瘤中的阳性表达率为79.5%，阳性表达率较高与骨肉瘤的恶性程度较高有关. 同时，Bcl2蛋白的表达与患者年龄、性别、5 a生存状态有着相关性，年龄大、女性患者以及发生死亡的患者中表达较高，其在骨肉瘤的临床诊断和判定预后中有一定价值［9］. Strasser等［10］报道，bc12基因表达可以使热诱导的细胞凋亡下降，并促使细胞继续增殖，形成热耐受. 因此，bcl2基因是一种广义的抗凋亡基因. 在我们的实验中发现，43℃ 1 h热疗后骨肉瘤的Bcl2蛋白表达水平明显下降，热疗可能是通过下调bcl2的基因表达诱导肿瘤调亡. 这些结果为骨肉瘤的中低温度热疗提供了部分的实验依据.
基金项目：国家自然科学基金（30471988）
【

参考文献

】
　　［1］ Fan QY， Ma BA， Zhou Y， et al. Bone tumors of the extremities or pelvis treated by microwaveinduced hyperthermia［J］. Clin Orthop Relat Res， 2003，406:165-175.

　　［2］ 张殿忠，范清宇，马保安，等. 人成骨肉瘤细胞系（OS9901）的构建与生物学特性［J］. 第四军医大学学报，1999， 20(12): 1048-1050.

　　［3］ Stewart JR， Gibbs FA. Hyperthermia in the treatment of cancer， perspectives on its promise and its problems［J］. Cancer， 1984，54(11 Suppl): 2823-2830.

　　［4］ Burd R， Dziedzic TS， Xu Y， et al. Tumor cell apoptosis， lymphocyte recruitment and tumor vascular changes are induced by low temperature， long duration (feverlike) whole body hyperthermia［J］. J Cell Physiol，1998，177(1): 137-147.

　　［5］ Giovaneva B. Heat Shock Proteins［A］//Bicher HI. Consensus on hyperthermia for the 1990s: clinical practice in cancer treatment ［M］. New York: Plenum Press， 1990:95-97.

　　［6］ Overgaard K， Overgaard J. Investigation on the possibility of a thermic tumor therapy Ⅱ. Action of combine heatroentgen treatment on a transplanted mouse mammary carcinoma［J］. Eur J Cancer， 1972，8(3):573-575.

　　［7］ Gerschenson LE， Rotello RJ. Apoptosis: A different type of cell death［J］. FASEB J， 1992，6(7):2450-2455.

　　［8］ Stephens LC， Hunter NR， Ang KK， et al. Development of apoptosis in irradiated murine tumors as a function of time and dose［J］. Radiat Res， 1993， 135(1): 75-80.

　　［9］ 高天，郭乔楠. 人骨肉瘤中bcl2的表达与凋亡指数的关系及其临床意义［J］. 诊断病理学杂志， 2006， 13(5): 365-367.

　　［10］ Strasser A， Anderson RL. Bcl2 and thermotolerance cooperate in cell surviva1［J］. Cell Growth Differ， 1995，6(7):799-805.

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