神经生长因子对新生大鼠HIBD后海马区凋亡有关蛋白表达的影响

　　　　　　　　　　 作者：胡伟，巩守平，李文妍，王岗，黄绍平

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of nerve growth factor (NGF) on the expression of apoptosisrelated proteins (Bcl2， Bax)in hippocampus of neonatal rats following hypoxicischemic brain damage (HIBD)， and its molecular biological mechanism. METHODS: Seventytwo rats were randomly pided into control group， HIBD group and NGF group. The rat models of HIBD were established by modified RICE method. Immunohistochemistry and TUNEL staining were employed respectively to detect the expressions of Bcl2 and Bax and the number of apoptotic hippocampal neurons. RESULTS: More or less apoptotic neurons could be observed in hippocampus in HIBD group and the level of Bcl2 expression was elevated slightly， while Bax expression was significantly higher than that in control group. After NGF administration， the number of apoptotic neurons was decreased (P&<0.01)， Bcl2 expression increased (P&<0.01) and Bax expression decreased remarkably (P&<0.01) as compared with HIBD group. CONCLUSION: The administration of NGF may increase Bcl2 expression and decrease Bax expression after HIBD in neonatal rats， thus inhibiting the apoptosis in hippocampus.
　　【Keywords】 nerve growth factor; hypoxiaIschemia， brain; brain injuries; hippocampus; apoptosisrelated protein
　　【摘要】目的： 应用新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（HIBD）模型，观察神经生长因子对海马区细胞凋亡及相关蛋白Bcl2和Bax的影响，探讨其神经保护作用的分子生物学机制. 方法： 72只大鼠随机分为对照组、HIBD组和NGF治疗组. 应用改良RICE法制作大鼠HIBD模型，TUNEL法检测各组动物海马区细胞凋亡数，免疫组化染色观察Bcl2， Bax蛋白的表达. 结果： 与假手术组相比，新生大鼠HIBD后海马区存在不同程度的细胞凋亡，Bcl2表达轻度升高，Bax表达明显升高. 与HIBD组比较，NGF治疗后，凋亡细胞减少（P&<0.01），Bcl2蛋白表达升高（P&<0.01），Bax表达下降（P&<0.01）. 结论： HIBD后，新生大鼠海马区细胞存在细胞凋亡，NGF治疗增强Bcl2表达，减少损伤基因Bax表达，抑制细胞凋亡，具有脑保护作用.
　　【关键词】 神经生长因子；缺氧缺血，脑；脑损伤；海马；凋亡相关蛋白
　　0引言
　　缺氧缺血性脑损伤(hypoxicischemic brain damage， HIBD)是由于宫内窘迫、新生儿窒息等引起的新生儿脑部严重损伤，有较高的发病率和死亡率， 也是导致智能落后和脑性瘫痪等儿童伤残的主要原因［1］. HIBD发病机制复杂，涉及多个环节，而凋亡是后期神经细胞缺失和功能障碍的主要原因. 细胞凋亡持续时间较长，适当的治疗可逆转凋亡的病理过程而改善预后. 本实验应用新生大鼠HIBD模型，以神经生长因子(nerve growth factor， NGF)进行治疗，观察NGF对新生大鼠HIBD后海马区细胞凋亡及相关蛋白Bcl2和Bax的影响，探讨其神经保护的分子生物学机制，以探讨HIBD更为有效的治疗途径和方法，为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxicischemic encephalopathy， HIE)提供理论依据.
　　1材料和方法
　　1.1材料新生7 d龄SD大鼠72只，雌雄不拘，体质量11～16 g，由第四军医大学医学动物实验中心提供. 注射用鼠神经生长因子(NGF恩经复)（厦门北大之路生物工程公司）；兔抗大鼠Bcl2多克隆抗体，小鼠Bax mAb，免疫组化染色SP试剂盒，细胞凋亡检测试剂盒（武汉博士得生物工程公司）.
　　1.2方法
　　1.2.1动物模型制备参照文献［2］制作HIBD模型：大鼠乙醚麻醉后，游离左颈总动脉并永久结扎，术后水浴箱恢复1 h，再置于37℃自制缺氧舱中，以3 L/ min速度持续输入含80 ml/L氧气的氮氧混合气体2 h，制成HIBD模型.
　　1.2.2动物分组大鼠随机分为3组： ① 对照组： 24只（假手术处理，仅游离左颈总动脉，不结扎亦不缺氧）；② HIBD组：24只，RICE法制备HIBD模型后腹腔注射生理盐水，间隔24 h，连用7 d；③ NGF组： 24只，HIBD模型后即刻以NGF1000 U/kg腹腔注射，间隔24 h，连用7 d.
　　1.2.3脑组织病理学测评HIBD后6， 24， 72 h和7 d时间点取脑，参照图谱，取含海马脑组织，行4 μm连续冠状切片. HE染色，光镜下观察海马区细胞层结构；取与HE相邻切片，TUNEL染色，计数海马区凋亡细胞数；每一标本取2张切片，每张切片取6个视野 (CA1区3个视野，CA3区3个视野)，取两张切片的均值作为该标本结果，以该组6例样本均值作为该组实验结果. 免疫组化染色检测海马区神经细胞bcl2，Bax蛋白表达. 结果用Q550CW型图像信号采集与分析系统进行处理，每张切片在海马区随机取6个位置相应、不重复的视野(CA1区3个视野，CA3区3个视野)，应用Qwin软件测量灰度值，取6个视野均值作为该片灰度值，每样本两张切片均值作为该样本实验结果，再以该组6例样本的均值作为该组实验结果.
　　统计学处理： 所有计量数据输入SPSS11.0统计软件分析处理，结果以x±s表示，多组间比较进行单因素方差分析(ANOVA)，两两比较用Turkey方法，P&<0.05为有统计学意义.
　　2结果
　　2.1海马细胞层结构和海马区凋亡细胞光镜下，对照组海马锥体神经元呈多层分布，细胞排列整齐，形态正常，无神经细胞缺失；HIBD组缺氧缺血（hypoxicischemic， HI）后6 h细胞肿胀，细胞排列紊乱，HI后24 h细胞肿胀明显，出现变性、坏死；HI后72 h细胞变性、坏死明显；HI后7 d海马区细胞片状坏死，细胞消失，空泡形成. NGF组各时间点病理变化较HIBD组轻，细胞排列尚规则，仅见斑点状神经元变性、坏死. 光镜下胞核呈棕黄色表现者为TUNEL染色阳性细胞，即凋亡细胞(表1). 对照组偶见凋亡细胞，HIBD组HI后6 h开始出现凋亡细胞，持续至7 d；各时间点NGF组凋亡细胞数少于HIBD组（P&<0.05，图1A，B，C).
　　表1大鼠左侧海马区细胞凋亡数目的变化（略）
　　bP＜0.05 vs 假手术， cP＜0.05 vs HIBD组.
　　A: 假手术组; B: HI后72 h; C: NGF组72 h.
　　图1海马CA1区凋亡细胞Tunel ×400（略）
　　2.2各组新生鼠海马区Bcl2，Bax蛋白表达的变化光镜下Bcl2，Bax蛋白表达以细胞浆呈棕黄色为阳性细胞(图2A，B，C；图3 A，B，C). 各时间点海马区Bcl2，Bax蛋白灰度值有一定差异(表2).
　　A: 假手术组; B: HI后24 h; C: NGF组24 h.
　　图2海马CA3区Bcl2表达免疫组化 ×400（略）
　　3讨论
　　细胞凋亡是控制神经系统生长发育动态平衡的必要手段［3］. 凋亡调控基因包括ICD/CED基因， Bcl2基因， p53基因， Fas/Apo基因及Cmyc基因等，目前认为Bcl2基因家族是与HIBD中凋亡最密切的调控基因之一. Bcl2和Bax分别是抑制和促进细胞凋亡的功能相反的两类蛋白质，都定位于线粒体膜上，在细胞凋亡中发挥重要的调节作用. Bcl2具有很强的抗凋亡作用［4］，它可以减少线粒体膜的通透性及阻止细胞色素C的释放，因而可阻止凋亡启动因子从线粒体向胞质的释放，切断了细胞凋亡级联式反应中的关键性环节. 而Bax作为Bcl2基因家族的一员，具有对抗Bcl2蛋白抑制凋亡的作用，其过度表达可促进细胞凋亡. 本实验显示，HIBD后6 h可见阳性凋亡细胞出现，24 h后明显增多，72 h达高峰. 而Bcl2蛋白表达在HIBD后6 h出现，24 h达高峰，灰度值最低，后逐渐升高，持续至7 d. 脑损伤后6 h可见Bax蛋白表达，72 h表达最强，此后随时间延长逐渐下降. Bcl2基因表达主要出现在HIBD后早期，24 h后Bcl2基因表达减弱，Bax蛋白表达逐渐增强，凋亡细胞逐渐增加，提示Bcl2基因表达对HIBD损伤的脑神经细胞具有保护作用；损伤后Bax表达高峰时间与凋亡高峰时间分布一致，提示Bax介导了细胞凋亡. 是何因素激活Bcl2基因，又通过什么机制导致激活的基因失活，目前尚未确定. 有研究认为，细胞质存在诱导转录因子，可介导细胞质基因表达来调节细胞的生存［5］. 在诱导核基因转录的核因子(NF)中NFkB倍受重视，有学者用特异性抑制剂抑制后Bcl2基因表达明显下降，阳性凋亡细胞显著增多，提示Bcl2基因的表达是一种细胞自我生存保护的一种机制，而NFkB对Bcl2基因的激活起重要作用［6］.

　　A: 假手术组; B: HI后72 h; C: NGF组72 h.
　　图3海马CA1区Bax蛋白表达免疫组化 ×400（略）
　　表2大鼠左侧海马区Bcl2和Bax表达的灰度值（略）
　　bP＜0.05 vs假手术， cP＜0.05 vs HIBD.
　　研究表明，外源性NGF能进入小脑和海马，其机理尚不清楚，有研究者认为在这些脑区中，NGF通过“旁路”有效地透过血脑屏障［7］. 而脑损伤后，血脑屏障受损，通透性更高. 我们的实验结果证实，腹腔注射NGF治疗后，相对于HIBD组，在损伤的各个时相新生大鼠海马区凋亡细胞数目均明显减少，Bcl2的表达明显增强，在24 h达到高峰，Bax表达减弱. 说明NGF可通过促进HIBD后抑凋亡基因Bcl2的表达，抑制Bax表达，从而抑制神经细胞凋亡，此与以往的研究结果相符［8-9］. 　　
　　NGF抑制HIBD后神经细胞凋亡可能是多因素的，包括促进Bcl2表达、抑制Bax的表达、抗氧化物酶的活化或增加以及钙稳定等多种方式. 对于NGF通过何种途径来调节Bcl2和Bax表达的，还有待进一步研究.
基金项目：陕西省2004年社会发展科技攻关项目（2004K11G9）

参考文献

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