关于hUNC93B1基因的克隆、表达纯化及抗体制备

　　　　　　　　　　 作者：蔡宇红 张铁柱 毛云英

　　【Abstract】AIM: To construct the prokaryotic expression vector containing hUNC93B1 gene， then induce the expression of this gene and purify the fusion protein， and at last using target protein to make the specific and high titer antibody. METHODS: The specific primers of hUNC93 gene were designed and the gene was amplified by PCR. The PCR product was then ligated into pMD18T vector. After sequence analysis， it was subcloned into pRSETA which could express the target protein as a (His)6tagged fusion. The bacterial strain BL21 (DE3) was used as the host cell to induce the expression of the fusion protein by IPTG. The purified hUNC93B1 fusion protein was easily achieved on a Ni2NTA affinity column by virtue of its (His)6 tag. Rabbits were immuned with the expressed protein and immunological adjuvant for specific antibody preparation. RESULTS: An 1808bp length fragment was amplified by PCR. The sequence was completely matched with hUNC93B1 gene sequence registered in Genbank; hUNC93B1pRSETA vector was successfully constructed. After the fusion protein was transfected into E.coil， a Mr 72 000 new protein was got by IPTG induction. A specific and high titer anti hUNC93B1 serum in 1∶64 000 was gained at last. CONCLUSION: hUNC93B1 gene has been successfully cloned and hUNC93B1 fusion protein has been correctly expressed in E.coil and purified by Ni2NTA agarose beads. A specific and high titer antibody has been prepared. All this makes it possible to do further investigation on the relationship between hUNC93B1 and heart failure.
　　【Keywords】hUNC93B1 gene; cardiovascular diseases; gene expression; protein purification
　　【摘要】目的： 构建人hUNC93B1基因的原核表达载体，诱导其表达并纯化该蛋白，制备特异性高效价抗体. 方法： 设计针对hUNC93B1基因的特异性引物，通过PCR的方法扩增目的基因，克隆入pMD18T载体，测序全部正确后亚克隆入原核表达载体pRSETA. 将构建的载体导入大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达. 经SDSPAGE电泳鉴定后用镍柱纯化融合蛋白. 与免疫佐剂联用，免疫家兔制备特异性抗体. 结果： PCR扩增得到长度为1808 bp的片断，结果与GenBank中人hUNC93B1的基因序列完全一致，成功构建了原核表达载体hUNC93B1pRSETA. 导入大肠杆菌后经诱导得到一条约Mr 72 000的新蛋白条带. 免疫家兔后获得了1∶64 000的高效价特异性抗人hUNC93B1血清. 结论： 成功地克隆了人hUNC93B1基因，使其编码的蛋白质在原核细胞中顺利表达，并纯化出该种蛋白. 制备了特异性抗体，为研究hUNC93B1基因与人类心血管疾病的关系提供依据.
　　【关键词】 hUNC93B1基因；心血管疾病；基因表达；蛋白纯化
　　0引言
　　
　　hUNC93B1基因最早是由Kashuba等人于2002年最早发现并克隆的，该基因定位于11q13染色体上，由11个外显子组成，cDNA全长2282bp， 编码597个氨基酸，表达的蛋白质Mr66600，GenBank 登陆号为：NM_030930［1］. hUNC93B1具有高度的保守性，与鼠的mUnc93b，鸡的cUnc93b，线虫的unc93和果蝇的AF145657等具有很高的同源性. 线虫的unc93基因对肌肉的收缩和及其共济运动具有重要的作用，当unc93基因发生等位基因的突变时，线虫将发生运动迟缓，并伴发运动的共济失调现象［2］. 为研究hUNC93B1基因与人心血管疾病之间的具体机制，我们设计了针对人hUNC93B1的特异性引物，通过PCR的方法扩增得到该基因片段，测序全部正确后亚克隆入原核表达载体，构建了hUNC93B1pRSETA载体. 转化入大肠杆菌BL21中，诱导表达并纯化出该蛋白. 用表达的蛋白免疫家兔，以获得了特异性和效价都相对较高的多克隆抗血清.
　　1材料和方法
　　1.1材料质粒pRSETA ，感受态细胞 BL21和XL10由本校生化教研室提供，PCR引物由北京赛百盛公司合成；人脑cDNA组文库购自Clontech公司，质粒提取和PCR产物胶回收试剂盒购自安徽优晶生物工程有限公司；Taq DNA 聚合酶，PCR marker，T4 DNA 连接酶，pMD18T 载体，SacI， HindIII及IPTG均购自大连宝信生物公司. 金属螯合亲和层析中所用Ni2+NTA琼脂糖介质购自Qiagen公司；HRP标记的羊抗兔二抗购自Santa Cruz Biotechnology；Western 发光底物为Pierce 产品.

　　1.2方法
　　1.2.1引物设计搜索GenBank中hUNC93B1 基因的DNA序列(NM_030930)，利用Primer Premier 5.0软件，在其编码区的两端设计一对引物，序列：Up为5′GC GAGCTC ATG GAG GCG GAG CCG CCG CTC3′；Low为5′GC AAGCTT TCA CTG CTC CTC CGG CCC GTC3′，用于RTPCR扩增大鼠NT3的cDNA. 在上游引物中引入SacI酶切位点，在下游引物中引入HindIII 酶切位点， 产物为1808 bp.
　　1.2.2PCR 扩增hUNC93B1的cDNA取1 μL人脑cDNA的文库为模板，在25 μL反应体系中先将模板于95℃变性5　　min，加入1 U Taq DNA聚合酶，在PE2400 PCR 循环仪中反应， 用12 g/L琼脂糖凝胶电泳检查PCR产物.
　　1.2.3DNA序列测定和载体构建PCR 扩增产物用安徽优晶生物工程公司胶回收试剂盒回收，将回收的目的片段克隆到测序载体pMD18T中，送上海基康公司进行DNA测序. 序列测定所用的引物分别是M13r(-48)和 M13f (-47). 由于目的片段过长，另送一对针对该基因的测序引物，5′CTTCCTGGCCATGCTGCTGGTGC3′和5′GCACCAGCAGCATGGCCAGGAAG3′. 用SacI/HindIII双酶切将测序全部正确的hUNC93B1片段从测序载体pMD18T中切下，插入pRSETA表达载体中，构建重组原核表达载 hUNC93B1pRSETA.
　　1.2.4融合蛋白表达和纯化将重组质粒hUNC93B1pRSETA转化入BL21感受态细胞中，挑选阳性克隆，在LB培养基中（0.1 g/L氨苄青霉素）培养过夜，取50 μL菌液转接5 mL含氨苄青霉素的LB中，培养大约3 h后，待A600 nm值达0.4~0.5 时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L诱导表达，继续培养5 h后，收取菌体（-70℃冻存）. 加入裂解缓冲液（Nah3PO4 50 mmol/L， NaCl 300 mmol/L， 1 mmol/L PMSF， pH 8.0），超声裂菌（输出频率为65 Hz， 4℃， 6次，每次10 s）， 离心（12 000 r/min， 4℃， 50 min）. 分别取适量上清和沉淀进行SDSPAGE，分析目的蛋白的分布情况. 用金属螯合亲和层析法纯化目的蛋白.
　　1.2.5家兔抗人hUNC93B1抗血清的制备及效价检测取纯化后的蛋白样品定量，分别以1 mg/kg 蛋白样品加入1 mL弗氏完全佐剂初次免疫3只家兔（背部皮下多点注射，下同），14 d后以0.5 mg/kg蛋白样品加入1 mL弗氏不完全佐剂加强免疫，以后每10 d加强免疫一次，于第4次加强免疫后7 d取家兔血清，纯化后的蛋白样品以5×10-3g/L的浓度包被ELISA板，间接ELISA法检测人hUNC93B1多克隆抗血清的效价.

　　1.2.6抗体纯化将纯化的6HishUNC93B1融合表达蛋白约1 mg进行SDSPAGE电泳，再转移到硝酸纤维素膜（NC膜上），剪下抗原条带，用15 mL 50 g/L脱脂奶粉（溶于TBST中）封闭1 h，加入100 μL抗血清，4℃封闭过夜，0.15 mol/L NaCl漂洗NC膜20 min，再用TBST漂洗2次，每次20 min，弃洗液. 在膜上加1 mL洗脱缓冲液（0.2 mol/L甘氨酸，pH 2.8； 1 mmol/L EGTA），轻摇15 min，加入1 mol/L Tris碱约55 μL中和至pH值接近中性，即得到纯化的抗血清，再用 Western Blot 测定.
　　2结果
　　2.1人hUNC93B1 cDNA的克隆及序列测定应用PCR的方法，从人脑cDNA文库中扩增得到大约1808 bp的人hUNC93B1 cDNA片段（图 1），扩增产物相对特异. 将目的片段克隆到测序载体pMD18T中，进行DNA测序，测序结果表明所克隆到的cDNA片段包含了人hUNC93B1全部的编码区序列，并且与GenBank (NM_030930)登录的序列完全一致.
　　M: DNA marker DL2000; 1: hUNC93B1.
　　图1PCR产物的琼脂糖凝胶电泳（略）
　　2.2表达载体的构建用SacI和HindIII将人hUNC93B1片段从测序载体pMD18T中切下，亚克隆入pRSETA原核表达载体中，构建出重组表达载体hUNC93B1pRSETA（图 2）.
　　M: DNA marker DL2000; 1， 2: 用SacI 和HindIII双酶切的重组载体; 3: 用SacI和HindIII双酶切pRSETA 空载体.
　　图2hUNC93B1pRSETA重组载体的酶切鉴定（略）
　　2.3hUNC93B1pRSETA融合蛋白的表达和纯化 将重组的原核表达载体hUNC93B1pRSETA转化入大肠杆菌BL21中，经IPTG诱导后获得Mr为72 000蛋白质的表达，除去6个组氨酸及多克隆位点的分子量后，与其Mr 66 600接近. 表明人hUNC93B1可以在LB培养液中融合表达. SDSPAGE电泳显示：融合的人hUNC93B1可诱导表达. 表达的融合蛋白质经Ni2+NTA 偶联的琼脂糖珠“锚定”纯化；在咪唑浓度为250 mmol/L的洗脱液中得到较高纯度蛋白质(图 3 ).

转贴于 　　M: marker; 1: 诱导前转化hUNC93B1pRSETA质粒的总菌体; 2: 诱导6 h后转化hUNC93B1pRSETA质粒的总菌体; 3: 上清中的融合表达蛋白; 4: 沉淀中的融合表达蛋白; 5: 用30 mmol/L咪唑洗脱的过柱液; 6: 用100 mmol/L咪唑洗脱的过柱液; 7: 用250 mmol/L咪唑洗脱的过柱液.

　　图3hUNC93B1pRSETA融合蛋白的表达及纯化分析（略）
　　2.4人hUNC93B1多克隆抗血清效价以正常兔血清作为阴性对照，空白对照调零后，测量A值，若免疫组的A值与阴性对照的A值大2.1倍（阳性）. 3只被免疫的家兔所得的血清效价均大于1∶16 000，其中1号家兔的抗体效价最好，达到1∶64 000. 这表明通过3次半量加强免疫得到了理想的高效价兔抗人hUNC93B1的血清（图 4 ）.
　　2．5Western Blot检测人hUNC93B1纯化抗体免疫所得到的高效价多克隆抗血清中必然存在一定的非特异性，通过固定于纤维素膜上的人hUNC93B1抗原亲和吸附抗血清，得到了相对高特异性的兔抗人hUNC93B1抗体（图 5）.
　　图4ELIS法检测兔抗人hUNC93B1多克隆抗体的效价（略）
　　A: 纯化前; B: 纯化后.　　1: 超声裂解后的上清; 2: 超声裂解后的沉淀.
　　图5血清抗体纯化前后特异性（略）
　　3讨论
　　hUNC93B1基因是Kashuba 等［1］人在第3号染色体上寻找抑癌基因的过程中偶然发现的. 最早发现的该基因片段与鸡Max基因（GenBank 登陆号：L12469）的5′非编码区有高度的同源性. 但通过cDNA文库筛选、RACEPCR和亚克隆等方法，最终确定该基因定位于11q13染色体上，由11个外显子组成， cDNA全长2282 bp ， 编码597个氨基酸. 经过BLASTX序列分析软件分析，该基因与线虫unc93蛋白的487个氨基酸具有21%的同源性，因此，将其命名为hUNC93B1. hUNC93B1属于hUNC93B基因家族的成员之一，该家族成员包括：hUNC93B1， hUNC93B2（定位于7号染色体， AC073648），hUNC93B3（定位于3号染色体， AC067827）和hUNC93B4 （定位于4号染色体， AC011744）. hUNC93B1基因的分布很广泛，几乎所有的组织中都有该基因的存在，其中心脏中表达量最高，其次为脑和肾脏，表达量最低的为胎盘. 这一分布特点提示：hUNC93B1基因可能与心脏的相应功能存在一定的相关性. Arnlov 等［4］于2005年最早提出：在人心肌中高表达的hUNC93B1的蛋白可能与老年人的左心室舒张功能异常、心衰的发病率和死亡率［5-7］存在一定的相关性.
　　
　　本实验利用人脑cDNA文库，成功地克隆到人的hUNC93B1基因， 测序正确后，亚克隆入pRSETA原核表达载体，经IPTG诱导后，得到了与预期相一致的蛋白条带. 可融性分析显示该融合蛋白以包涵体的形式存在. 通过Ni2+NTA 偶联的琼脂糖珠“锚定”纯化，我们初步得到了相对较纯的人hUNC93B1蛋白，与免疫佐剂联合应用免疫家兔后，得到了一株抗体效价为1∶64 000的兔抗人hUNC93B1的多克隆抗血清. 后经过抗体的纯化过程，进一步得到了抗体特异性相对较高的多克隆抗体. 所有上述工作，将为研究hUNC93B1基因与心血管疾病之间的相互关系奠定一定的基础.
【

参考文献

】
　　［1］ Kashuba VI， Protopopov AI， Kvasha SM， et al. hUNC93B1: A novel human gene representing a new gene family and encoding an unc93like protein ［J］. Gene， 2002， 283(12):209-217.

　　［2］ Levin JZ， Horvitz HR. The Caenorhabditis elegans unc93 gene encodes a putative transmembrane protein that regulates muscle contraction［J］. J Cell Biol， 1992，117:143-155.

　　［3］ Sollenberge KG， Kao TL， Taparowsky EJ. Structural analysis of the chicken max gene［J］. Oncogene， 1994， 9， 661-664.

　　［4］ Arnlov J， Sundstrom J， Lind L， et al.hUNC93B1， a novel gene mainly expressed in the heart， is related to left ventricular diastolic function， heart failure morbidity and mortality in elderly men ［J］. Eur J Heart Fail， 2005，7(6):958-965.

　　［5］ Andren B， Lind L， Hedenstierna G， et al. Left ventricular systolic function in a population sample of elderly men ［J］. Echocardiography， 1998， 15:315-324.

　　［6］ Sundstrom J， Lind L， Arnlov J， et al. Echocardiographic and electrocardiographic diagnoses of left ventricular hypertrophy predict mortality independently of each other in a population of elderly men［J］. Circulation， 2001，103:2346-2351.

　　［7］ Andren B， Lind L， Hedenstierna G， et al. Left ventricular diastolic function in a population sample of elderly males［J］. Echocardiography， 1998，15:443-450.