关于人工寒潮对高血压和正常血压大鼠脑血管收缩反应性的不同影响

论文网：

　　　　　　　　 作者：施晓耕，梁凤萍，黄聿，黄如训

　　【Abstract】 AIM: To examine the influence of artificial cold exposure (ACE) on cerebrovascular responses to receptordependent and receptorindependent vasoconstrictors in renovascular hypertensive rat(RHR) and normal SD rat. METHODS: Twentyfour rats were randomly pided into 4 groups: RHR， RHT+ACE， SD and SD+ACE (n=6/group). RHR(SBP&>200 mmHg) was reproduced by twokidney and twoclip(2k2c) way. Segments of the middle cerebral artery (MCA) from the 4 groups were mounted in Multi Myograph System for measurement of isometric contractions and cumulative concentrationdependent contraction to endothelin1， U46619， phenylephrine， and extracellular K+ in normal Krebs solution. RESULTS: There was no significant difference in vasoconstriction induced by phenylephrine， thromboxane A2 analog U46619， endothelin1 or high K+ in MCA between RHR and RHR+ACE. However， the constrictions to these constrictors were reduced in RHR and RHR+ACE compared with vessels from SD and SD+ACE. CONCLUSION: ACE results in a significant reduction in vasoconstrictive response to both receptordependent and independent constrictors in MCA of SD rats， not RHR.
　　【Keywords】 artificial cold exposure; renovascular hypertensive rat; stroke; vascular responsiveness
　　【摘要】目的： 检测肾血管高血压大鼠(RHR)和SD大鼠离体大脑中动脉（MCA）对于血管收缩剂的张力反应差异，探讨ACE对不同血压大鼠脑血管反应性的不同影响及其意义. 方法： 将双肾双夹（2k2c）法复制成功的RHR［SBP&>200 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）］及正常血压的SD大鼠各分为寒潮和非寒潮共4组（6只/组），单笼放置于ACE和室温环境3 d后，显微操作分离MCA制作离体动脉环，等张收缩法测定离体血管张力及其对于受体依赖药(phe， U46619， ET1)和非受体依赖的(高K+)血管收缩剂的反应. 结果： ① 人工寒潮减弱SD大鼠phe，U46619，ET1和高K+诱导MCA的血管收缩反应；② 与SD相比，以上血管收缩反应在RHR都隆低；③ 对于RHR而言，人工寒潮对于RHR的MCA血管收缩反应与室温组相比没有统计学改变. 结论： 严重高血压的RHR脑动脉功能受损，其MCA血管收缩反应能力低于SD，而且在寒冷时丧失了进一步减弱收缩的调节保护能力.
　　【关键词】　人工寒潮；脑卒中；肾血管性高血压大鼠；血管反应性
　　0引言
　　临床研究和流行病学资料显示，在寒冷季节，尤其是气温骤降的寒潮时，脑卒中发病明显增多［1］. 流行病学调查发现的另一个与之相似的现象是：寒冷能够诱发高血压［2］. 这二者之间的相关性是寒潮诱发卒中系列课题的研究目的之一［3］. 我们前一阶段的动物实验结果显示3 d间歇的人工寒潮（artificial cold exposure， ACE）能够使肾血管性高血压大鼠（renovascular hypertensive rat， RHR），特别是严重高血压的RHR脑卒中的发生率显著升高，但是并不伴随血压升高，反而是有所下降，与此同时，ACE能够引起SD大鼠SBP轻度升高［3］，这一结果提示我们， 高血压和正常血压个体对于寒冷引起的血管反应可能有所不同，与寒冷诱发RHR卒中的发生或有密切关系. 本研究我们通过ACE对RHR以及SD的大脑中动脉（MCA）对血管收缩剂的等张收缩反应来探讨高血压和正常血压大鼠的脑阻力血管反应性的差异，并进一步探讨它在寒冷诱发高血压动物脑卒中发生的意义和可能的机制.
　　1材料和方法
　　1.1材料体质量60～80 g 的封闭群雄性SD 大鼠24只( 香港中文大学实验动物中心提供). 乙酰胆碱（ACh）， 苯福林（phe）， U46619， ET1等药品均购自Sigma 公司. 除U46619外其他试剂储存液均以DDh3O配制，工作液以新鲜的Kerbs液稀释. U46619储存液以DMSO配制，工作液在实验当天以新鲜的Kerbs液稀释. 阻力血管收缩反应张力由多通道肌张力生物信号记录仪（Multi Myograph System， Danish Myo Technology， Myograph）测定. 血管外径和腔内压力通过软件MyoView (version 1.1 P， 2000， Photonics Engineering Ltd.， Denmark)记录和分析.
　　1.2方法
　　1.2.1模型制作及动物分组实验组12只大鼠按文献报道的双肾双夹法(2k2c)复制成RHR［4］ . 在22℃空调 房间以普通大鼠饲料喂养，自由饮用自来水. 对照组12只SD大鼠不做手术，相同条件饲养. 术后8 wk RHR组SBP全部达到或超过200 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，SD组SBP 110～130 mmHg. 人工寒潮实验:2K2C手术后8 wk开始ACE实验，共分为SD， SD+寒潮， RHR， RHR+寒潮4组，每组6只. 寒潮组：22℃空调动物房12 h(7 am～7 pm)，4℃冷房12 h(7 pm～7 am)为1 d循环，共3 d. 非寒潮组：22℃空调动物房 3 d.

　　1.2.2MCA离体动脉血管反应性测定大鼠称体质量，CO2麻醉后， 取出脑放在盛有新鲜配制的 Krebs 溶液(4℃ ) 的培养皿中， 并通以950 mL/L O2和50 mL/L CO2混合气（37℃）. 解剖显微镜下迅速清除血液、脂肪和结缔组织， 于近Willis 环段取下长约1.3～1.6 mm ，直径约50～70 um的MCA血管段，加入不同浓度的各药物，以Myograph 记录MCA血管张力的变化.
　　
　　MCA血管的标准化：自动牵引钢丝将血管向其直径方向以1 mN的基础张力（静息张力）牵拉，并且固定于水浴槽中90 min，此时血管状态类似其正常功能时的生理状态，以下的实验均在此状态下完成.
　　
　　MCA血管张力的测定：首先给予激动剂60 mmol/L K+ 使小动脉产生张力，维持5 min后，以5 min末的激活张力作为100 %(张力单位为mN/mm) ，充分冲洗至基线. 静息30 min后，血管环首先用1 μmol/L 的Phe收缩然后以ACh舒张以确定血管内皮的存在. 之后以Krebs液清洗，恢复张力至基线，稳定60 min后开始实验，分别加入药物观察，所产生的效应以下一个浓度前的肌张力占激活张力的百分比表示，由此获得药物的量效曲线. 每做好一种药物的剂量反应曲线， 用37℃的Krebs 液冲洗6 次， 温育30 min ，待曲线恢复至基础张力后， 再作下一步实验. 每一动脉环只做3 个剂量反应曲线. 实验结束后， 测量血管内外径. 动脉环对血管收缩剂的收缩反应以mN/mm表示. 观察ET1 (1～50 nmol/L)、U46619 (1～100 nmol/L)、phe (0.03～30 μmol/L)、extracellular K+ (20～80 mmol/L)药物的剂量依赖性血管的收缩和舒张反应.
　　
　　统计学处理：结果用x±s表示，用Prism (version 3a; GraphPad Software， San Diego， CA)软件进行统计学处理，组间比较用twoway ANOVA以及两两比较法. P&<0.05认为有统计学差异.
　　2结果
　　
　　与SD相比，phe (30 nmol/L～30 μmol/L)引起的血管收缩反应较RHR减弱；寒冷减弱SD的血管收缩幅度，对RHR的血管收缩没有明显影响； phe引起各组大鼠MCA血管收缩的最大反应（Emax）为SD&>SD+寒潮&>RHR&>RHR＋寒潮，但RHR与RHR＋寒潮无统计学差异. U46619 (1～100 nmol/L)也可以引起SD大鼠MCA的剂量依赖收缩反应，但是，在RHR，U46619只引起微弱的脑血管收缩反应；另外，寒冷减弱U46619对SD血管收缩作用，对RHR的血管却没有影响. U46619引起各组大鼠MCA血管收缩的Emax为SD&>SD+寒潮&>RHR&>RHR＋寒潮，但RHR与RHR＋寒潮无统计学差异. SD的MCA对ET1(1～50 nmol/L)产生剂量依赖的张力改变，ET1引起血管收缩反应在RHR比SD减弱，寒冷减弱SD的血管收缩幅度，但是在RHR寒潮后后则没有进一步的抑制. 各组对于ET1引起血管收缩的Emax为SD&>SD+寒潮&>RHR&>RHR＋寒潮，但RHR与RHR＋寒潮无统计学差异. 与SD相比，高K+(20～80 mmol/L)引起的血管收缩反应在RHR减弱；寒冷减弱SD的血管收缩幅度，对RHR的血管收缩没有明显影响； 高K+引起各组大鼠MCA血管收缩的最大反应（Emax）为SD&>SD+寒潮&>RHR&>RHR＋寒潮，但RHR与RHR＋寒潮无统计学差异（表1）.

　3讨论
　　MCA是大脑的主要供血和阻力血管，具有很强的血管收缩舒张能力，在受到神经、体液刺激时通过动脉直径的自我调节以保持脑血流量稳定. 本研究我们采用多通道的Myograph仪测定RHR和SD大鼠MCA收缩反应性，组间重复性高，数据稳定，可比性强，为研究不同血压大鼠的脑血管张力变化提供了可靠的客观依据.
　　表1四组大鼠大脑中动脉对phe， U46619，ET1 和高K+的最大收缩反应比较（略）
　　本实验中RHR的MCA对于受体依赖和非依赖的血管活性药引起收缩反应较正常血压SD大鼠显著减弱. 而以往的文献报道显示慢性高血压动物（多数用2k1c大鼠）小动脉对于phe的收缩反应性升高［5］，其原因考虑为高血压时，较小动脉和小动脉会出现平滑肌细胞增生、肥大，血管管壁增厚，血管壁厚与管径之比提高. 这种改变可导致血管的收缩反应性增强，并具有“结构性放大器”的作用，使血压升高. 但是我们的实验却发现RHR大脑中动脉对于血管收缩剂的反应比较SD大鼠有明显减弱，可能的原因是上述实验采用高血压形成3～4 wk，血压160～180 mmHg的2k1c高血压大鼠，我们所采用的2k2c 的RHR血压增高的时间长（7 wk）、程度重（超过200 mmHg），在这种长期、严重的高血压的RHR，脑血管结构和功能已经严重损害，对于血管收缩剂的反应减弱.
　　正常血压大鼠经过慢性的寒冷暴露（4～5℃，持续3～4 wk）可以诱导高血压；经过寒冷暴露大鼠的体内、体外实验都表现出血管（主动脉）对于α1肾上腺素受体激动剂phe反应减弱，提示血管α1肾上腺素受体数量或者反应性在寒冷后下降［6］. 本实验的结果显示寒冷显著地减弱SD的MCA收缩幅度，在重度高血压的RHR却没有明显影响. 我们推论，其可能的原因是生理条件下，重要的器官如脑的阻力血管具有自我调节保护功能，在寒冷暴露后能够降低自身的血管张力，减弱对各种收缩剂的收缩反应，以保证脑的供血动脉不发生痉挛或者持续收缩引起脑缺血. 而长期、严重的高血压损害的肾性高血压大鼠，可能丧失了脑动脉自我调节保护机制.
　　
　　阻力血管收缩主要与血管中膜平滑肌有关，可以由受体依赖的(phe， U46619， ET1等)和非受体依赖的(高K+)血管收缩剂引起收缩反应［5］. 其中phe能够引起脑、心等脏器阻力血管的收缩，是血管生理药理实验的经典收缩剂，也是研究寒冷对机体影响的经典介质. U46619是血栓烷A2（TXA2）的类似物，后者是血小板聚集和血管平滑肌收缩的强烈刺激物，在心梗和动脉粥样硬化中起重要的作用. 我们的实验发现，U46614对于RHR的MCA所产生的收缩作用较弱，提示TXA2在高血压动物脑血管病变中所起的作用较小. ET1具有强烈、长效、广泛的（大、小脑动脉）的脑血管收缩作用，导致脑血管痉挛，进而引起脑缺血和神经功能的损害，而脑缺血以后，脑组织和血浆内的ET1浓度也会增加，引起继发的脑损害. 我们研究［7］发现人工寒潮初期会引起脑组织的ET含量增加，可能会对SD的MCA产生刺激并形成适应性的收缩反应减弱，但在RHR的脑动脉缺乏这样的调节保护反应.
　　
　　综上所述，本研究首次探讨了寒冷对于正常血压和肾血管性高血压大鼠的脑阻力血管张力影响的差异，发现了ACE导致正常血压的SD大鼠MCA血管收缩反应显著下降；RHR的MCA血管收缩反应能力显著低于SD大鼠，而且在寒冷时丧失了减弱收缩的调节保护能力，在寒冷刺激时发生可能到血管持续收缩甚至痉挛，与寒冷时脑卒中的发生有一定关系.
基金项目：国家自然科学基金（30471917）
【参考文献】
　　［1］Hong YC， Rha JH， Lee JT， et al. Ischemic stroke associated with decrease in temperature［J］. Epidemiology，2003，14:473-478.

　　［2］Sun Z， Wang X， Wood CE， et al. Genetic AT1A receptor deficiency attenuates coldinduced hypertension［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2005，288:R433-439.

　　［3］Huang RX， Xiao XH， Li L. Experimental study on the meteorological factors inducing the occurrence of stroke［J］. Chin J Geriatr，2001，20:366-368.

　　［4］Shi XG， Huang RX. Microarray analysis of acute gene expression profile in RHR after permanent MCA occlusion［J］. Chin J Nerv Ment Dis，2005，31:244-248.

　　［5］Ando H， Zhou J， Macova M，et al. Angiotensin II AT1 receptor blockade reverses pathological hypertrophy and inflammation in brain microvessels of spontaneously hypertensive rats［J］. Stroke， 2004，35:1726-1731.

　　［6］Fregly MJ， Brummermann M. Effect of chronic exposure to cold on vascular responsiveness to phenylephrine and angiotensin II［J］. Pharmacology，1993，47:237-243.

　　［7］Xie LC， Huang RX， Li CX. Experimental research of artificial cold stream on the occurrence of stroke［J］. Chin J Nerv Ment Dis，2004，30:198-201.