关于双功能自由基清除剂原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物对O2.-和.OH自由基的清除作用

　　　　　　　　 作者：王多宁　杨颖　赵雁武　弥曼　梅琪柄　石明娟　苏兴利　商亚娟　刘永英　　

【摘要】 目的： 研究原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物（PTC）对高脂血症模型大鼠血脂、主动脉组织形态学及肝组织抗氧化活性的影响. 方法： 60只SD大鼠随机分为6组（每组10只），即正常对照组、高脂血症模型组、药物对照组（即费非诺贝特组，0.04 g/kg）， PTC小剂量组（0.005 g/kg）， PTC中剂量组（0.05 g/kg）， PTC大剂量组（0.25 g/kg）. 在以高脂饲料喂养5 wk开始，正常对照组和高脂血症模型组给以5 g/L羧甲基纤维素钠水溶液10 mL/kg体质量灌胃. 其他实验组分别给以5 g/L羧甲基纤维素钠水溶液配成药物混悬液灌胃，每日一次. 实验到10 wk后全自动生化分析仪测定各组动物血脂，HE染色做病理切片观察大鼠主动脉形态学变化，同时测定肝组织超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT）活性及抑制羟自由基（.OH）的能力. 结果： 原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物能使模型大鼠肝组织清除羟自由基（.OH）的能力提高（P&<0.01）， SOD的活性增强（P&<0.01或0.05）；各剂量组均有降低血清胆固醇和提高血清高密度脂蛋白（HDLC）含量的趋势，但无统计学意义. 结论： 原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物在实验动物体内的确有清除超氧阴离子自由基（O2.-）和羟自由基（.OH）的双功能作用.

【关键词】 原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物；自由基清除剂；超氧化物类；羟自由基

　　【Abstract】 AIM： To investigate the effects of protocatechualdehyde thiosemicarbazonecopper（II）complex (PTC) on the serum lipids， the aortic tectology and the activity of antioxidation in liver tissues of the hyperlipemia model rats. METHODS: Sixty healthy SD rats were randomly pided into 6 groups(10 rats per group)， including control group， hyperlipidemia model group， Fenofibrate drug group(0.04 g/kg) and 3 PTC groups， namely small dosage of PTC (0.005 g/kg) group， moderate dosage of PTC (0.05 g/kg)group， large dosage of PTC (0.25 g/kg)group. Control group was fed by ordinary forage;the other groups were fed by highlipid forage. From the 5th week， besides the above feeding， control group and model group were administrated intragastrically 5 g/L Carboxy Methyl Cellulose(CMC); Fenofibrate drug group and 3 PTC groups were respectively administrated intragastrically suspension with Fenofibrate and CMC， and suspension with PTC and CMC. After 10week feeding， the levels of serum lipids were determined; aortic histomorphological changes were observed by the pathological section with the HE staining; the activities of superoxide dismutase(SOD) and catalase(CAT)， and the restraining ability to hydroxyl free radical(.OH) in the liver tissues were measured. RESULTS: PTC could restrain .OH (P&<0.01) and enhance the activities of SOD (P&<0.01 or P&<0.05). Every PTC group had tendencies to decrease cholesterol and to increase highdensity lipoprotein cholesterol， but there had no significance in statistics(P&>0.05). CONCLUSION: PTC can certainly eliminate the superoxide free radical（O2.-）and .OH in experimental animals in vivo.

　　【Keywords】 protocatechualdehydethiosemicarbazone copper（II）complex(PTC);　free radical scavengers; superoxides; hydroxyl radical

　0引言

　　研究表明，许多疾病的发生和发展均涉及自由基的损伤作用. 自由基的过度生成会导致人体氧化损伤，使人出现疾病和衰老加速. 人在年轻的时侯，过氧化物、自由基和抗氧化剂、自由基清除剂处于一种相对平衡状态，在受外界不良因素的影响或随着年龄增长，体内自由基的生成增加，抗氧化酶、自由基清除剂活性降低或生成减少，使这种平衡紊乱，就会出现疾病、衰老等不健康状态. 由于自由基的多态性和反应的多种形式，单一自由基清除剂或抗氧化剂虽在实验室取得明显效果，但转化为有效产品服务人类，一直是个难题. 天然酶如SOD虽然具有特异的清除超氧阴离子自由基（O2.-）的作用，在国外已进行了临床应用，但由于其价格昂贵，且在稳定性、膜穿透性、生物利用度和免疫原性等方面的原因而受到限制；另外，SOD在歧化O2.-的过程中，有可能通过HaberWeiss反应产生毒性更强的.OH而对机体产生更大的危害. 因此，寻找高效、低毒、多功能自由基清除剂就成为当前人们很感兴趣的研究课题，尤其以席夫碱为配体的金属SOD模型配合物的合成、表征及构效关系的研究倍受关注［1］.
　　
　　我们的实验以丹参的有效成分原儿茶醛和氨基硫脲为主要原料，合成了原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物，并初步研究了其体外对氧自由基的清除作用和体内生物学效用［2-3］，本实验用高脂血症大鼠动物模型，观察了原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物对超氧阴离子自由基（O2.-）和羟自由基（.OH）的清除作用.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　1.1.1动物 健康SD大鼠，清洁级，体质量180~200 g，由第四军医大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（军）2002006.

　　1.1.2药品原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物(PTC)，由本室合成;非诺贝特，法国利博福尼制药公司生产(批号：84564).

　　1.1.3主要试剂超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒、羟自由基（.OH）测定试剂盒购自南京建成生物工程有限公司.

　　1.1.4仪器日立 7 080型全自动生化分析仪； 721分光光度计，上海第三分析仪器厂；DG3035酶联测定仪，华东电子管厂；均质机，上海弗鲁克机电设备有限公司；TDL5低速离心机，上海安亭科学仪器厂.

　　1.2方法

　　1.2.1动物模型的建立及分组采用高脂饲料喂养SD大鼠复制高脂血症模型. 选用SD大鼠60只，雌雄各半，适应性饲养1 wk后，按性别随机分为 6组：即正常对照组，模型组，非诺贝特组（0.04 g/kg体质量），PTC小剂量组（0.005 g/kg体质量），PTC中剂量组（0.05 g/kg体质量），PTC大剂量组（0.25 g/kg体质量），每组10只. 正常对照组组喂普通饲料，其他4组均喂高脂饲料（高脂饲料配方：20 g/kg胆固醇、3 g/kg去氧胆酸钠、75 g/kg猪油、50 g/kg蛋黄粉、852 g/kg基础饲料混均匀压成块料），均自由摄食、饮水.

　　1.2.2给药自实验第5周开始，正常对照组、模型组以5 g/L羧甲基纤维素钠水溶液10 mL/kg体质量灌胃，其他组皆用5 g/L羧甲基纤维素钠水溶液配成药物混悬液灌胃，每日一次. 实验周期共10 wk.

　　1.2.3样品制备及检测

　　1.2.3.1取血及血脂测定实验10 wk后，禁食不禁水12 h，断头取血，3500 r/min离心10 min取血清. 胆固醇 (CHOL) 及三酰甘油 (TG) 采用终点法、高密度脂蛋白 ( HDLC) 采用一步法测定. 试剂盒由北京利德曼生化技术有限公司生产.

　　1.2.3.2取组织及做SOD， CAT及清除.OH活性测定大鼠断头处死后，立即取肝脏，用生理盐水清洗，立即置低温冰箱(-40℃)备用. 在测定之前，在冰浴中用生理盐水制成不同浓度的组织均浆，按试剂盒说明做SOD， CAT及清除.OH活性测定，同时用考马斯亮蓝法［4］测定组织均浆中的蛋白含量.

　　1.2.3.3病理形态学观察断头处死动物，快速在主动脉弓与胸主动脉交界处取约1 cm血管，用生理盐水轻轻冲洗后，置40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，制备石蜡切片，HE染色，光镜观察病理改变.

　　1.2.3.4数据处理数据用x±s表示，采用 SPSS10.0软件包进行统计处理，组间比较用方差分析，两两比较用SNK.

　　2结果

　　2.1PTC对大鼠血脂含量的影响高脂血症模型组大鼠血清CHOL， HDLC 较正常对照组升高，有显著性差异（P&<0.05），TG无显著差异；非诺贝特组与模型组比较，血清CHOL降低， HDLC升高，有显著性差异（P&<0.05）；其他组无显著性差异；另外，由于实验动物性别差异较大，测定的标准差相对较大. 其结果见按表1.表1PTC对大鼠血脂含量的影响（略）

　2.2主动脉壁组织形态学变化实验大鼠主动脉HE染色光镜病理切片显示，正常对照组动脉内膜光滑，内皮细胞完整，内膜下间隙较小，平滑肌细胞排列整齐，胞浆染色红染；模型组内皮细胞广泛损伤脱落，脂质沉积，见平滑肌细胞胞浆空泡状，胞浆疏松淡染，平滑肌细胞排列紊乱，可见有巨噬细胞；药物对照非诺贝特组内膜光滑完整，平滑肌细胞排列较整齐，有增生，胞核密度增加，一些平滑肌细胞有空泡状改变；PTC各剂量组血管平滑肌均排列整齐，内皮完整，平滑肌细胞脂质沉积模型组比较明显减轻，可见巨噬细胞. 见图1.

　　2.3PTC对实验大鼠SOD， CAT活性的影响实验大鼠肝组织SOD活性，模型组与正常对照组比较，有下降趋势，但无统计学意义；PTC各剂量组与模型组、正常对照组比较均增高，有差异（P＜0.05），PTC小剂量组增高更加明显（P&< 0.01）. 而大鼠肝组织CAT活性，模型组与正常对照组比较，有下降趋势，PTC各剂量组与模型组、对照组比较都有增高趋势，但无统计学意义. 见表2.

　　2.4PTC对大鼠肝组织抑制.OH 的活性作用实验大鼠肝组织抑制.OH的活性测定结果，模型组与正常对照组比较，其抑制.OH的活性降低(P&<0.01），而PTC各剂量组及非诺贝特组与模型组比较，其抑制.OH的能力均增强 (P&<0.01)，且PTC组有随剂量的增大而增强的趋势(表2). 表2PTC的清除自由基作用（U/mg， x±s）

　　3讨论

　　心脑血管疾病是导致人类死亡的首位原因，而动脉粥样硬化(Atherosclerosis， AS)是众多心脑血管病的主要病理基础. 多年来，对于动脉粥样硬化的发病机制和预防治疗，医学科学工作者进行了不懈的探讨，己取得了很大成就. 但是，由于动脉粥样硬化是一个十分复杂的病理过程，其详细的发病机制至今尚未完全明确. 代谢综合症（MetS）是早期动脉粥样硬化患者发生血管疾病的高风险状态. MetS患者体内的脂蛋白中低密度脂蛋白（LDL）增高，这对氧化条件更加敏感. 脂蛋白氧化在体外通过酶的或非酶的抗氧化剂可以被抑制，但高密度脂蛋白（HDL)在保护LDL不被氧化过程中也发挥了关键性的作用［5］高脂血症与AS有密切的关系，尤其是胆固醇与三酰甘油皆增高的，患AS的危险性更大. 目前关于AS起因的一个流行的理论认为，AS开始于血管内皮细胞的损伤，引起一些血循环中的单核细胞浸润到内膜下，并在血管壁上成为巨噬细胞，活化了的单核细胞和巨噬细胞分泌O2.-， h3O2和水解酶损伤邻近细胞. 巨噬细胞释放因子可以刺激平滑肌细胞增生. 巨噬细胞释放血小板刺激因子使血小板黏附到损伤的内皮细胞上，进一步引起释放其他使平滑肌细胞增生的因子［6］. 在生物体内自由基的产生与消除是一个动态平衡的过程，自由基充当了普通反应介质的作用，它受到生物反应网络中其他生物活性分子的作用和调控［7］，自由基的产生与消除失衡，可能导致疾病的发生，如动脉粥样硬化.

　　关于高脂蛋白血症，按照高脂血症的定义，无论是胆固醇含量增高，还是三酰甘油的含量增高，或是两者皆增高，统称为高脂血症(hyperlipemia). 对于高脂蛋白血症模型，本实验采用高脂饲料喂养的方法，到实验的第10 wk结束测定，模型组血清胆固醇、高密度脂蛋白含量均增高，较正常对照组比较，相差显著（P&<0.05），三酰甘油变化不大，且实验动物的性别间差异较大. 从实验大鼠主动脉组织形态学变化看，高血脂症模型组内皮细胞广泛损伤脱落，脂质沉积，见平滑肌细胞胞浆空泡状，胞浆疏松淡染，平滑肌细胞排列紊乱，内膜可见巨噬细胞，说明模型复制成功.

　　我们的实验设计是基于，原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物从其分子结构上看，酚羟基和铜离子，具有清除O2.-的作用，而硫脲具有清除.OH的作用，设想二者在体内具清除O2.-和.OH的双功能作用.
　　我们的实验结果表明，PTC确能显著提高模型大鼠肝组织抑制.OH的能力，增强SOD活性，且其作用随剂量的增大而增强；而对CAT的活性作用影响较小，只有升高趋势，但无统计学意义；从组织形态学变化看，PTC各剂量组血管平滑肌均排列整齐，内皮完整，平滑肌细胞脂质沉积与模型组比较明显减轻，这说明原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物在体内确有清除O2.-和.OH自由基的能力；给与适当剂量的原儿茶醛缩氨基硫脲铜（II）配合物可以减轻高脂血症大鼠血管内皮细胞的病理性损伤.
　

基金项目：陕西省卫生厅科研基金项目（04D15）

【参考文献】
　　［1］Zhu XD， Wang CG， Le ZF， et al. Synthesis， characterization and scavenger effect on O2._ of copper (II) complexs derived from thiosemicarbazide［J］. Synth　　React Inorg Met Org Chem， 1991，21（9）:1365-1373.

　　［2］王多宁， 莫简， 孙淑芬，等. SOD模拟物PTC对O2-介导的氧化损伤的保护作用［J］. 第四军医大学学报， 1999，20(7):580-582.

　　［3］王多宁， 田芙蓉， 赵雁武，等. PTC对2Gy全身照射小鼠辐射损伤的防护作用［J］. 中华放射医学与防护杂志， 2001，21(1):45-46.

　　［4］王多宁， 田芙蓉， 赵雁武. 考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量［J］. 第四军医大学学报， 2001， 22(6): 528-529.

　　［5］Hansel B， Kontush A， BonnefontRousselot D， et al. Alterations in lipoprotein defense against oxidative stress in metabolic syndrome ［J］. Curr Atheroscler Rep， 2006，8（6):501-509.

　　［6］孙存普，张建中，段绍瑾. 自由基生物学导论［M］. 合肥: 中国科学技术大学出版社，1999：249-250.

　　［7］Mo J. A novel theory: Biological processes mostly involve two types of mediators， namely general and specific mediators endogenous small radical such as superoxide and nitric oxide may play a role of general mediator in biological processes ［J］. Med Hypotheses，2005，65:728-735.