关于自发性高血压大鼠肾αadducin基因表达的增龄性改变和盐摄入的影响

　　　　　　　　 作者：孙超峰，郝丽娜，吕颖，殷艳蓉，高海燕，程功

【摘要】 目的： 观察自发性高血压大鼠（SHR）肾脏αadducin基因表达增龄性改变的一般规律及高盐摄入对其的影响. 方法： 以雄性SHR为观察对象，按周龄分为幼年组（9 wk，13只）成年组（28 wk，15只） SHR和老年组（53 wk，13只）. 应用实时荧光定量PCR进行αadducin基因表达的检测. 结果： 成年组与幼年组SHR相比，肾脏αadducin基因表达无统计学差异(P＞0.05)；而老年组肾脏αadducin基因表达比成年组(0.37±0.12 vs 5.43±2.22， P＜0.05)和幼年组(0.37±0.12 vs 4.48±1.30， P＜0.05）降低，均具有统计学意义. 在各年龄组SHR中高盐组和正常盐组比较，肾脏αadducin基因表达无统计学差异(P＞0.05). 结论： SHR肾脏存在增龄性αadducin基因表达异常；短期高盐摄入对αadducin基因表达无明显影响.

【关键词】 αadducin基因； 高血压； 肾脏；年龄因素

　　【Abstract】 AIM: To examine the alteration of αadducin gene expression in the kidney of spontaneously hypertensive rats(SHR) with aging and to evaluate the effect of high sodium loading on it. METHODS: The expression of αadducin mRNA in the kidney of different age groups of male SHR (9， 28 and 53 wk) was detected using relative quantitative realtime polymerase chain reaction. RESULTS: αadducin mRNA expression in the kidney was not significantly different between 9weekold and 28weekold SHR(P＞0.05). Nevertheless， it was significantly lower in the 53weekold male SHR than in 9weekold SHR (0.37±0.12 vs 4.48±1.30， P＜0.05 ）and 28 weekold SHR (0.37±0.12 vs 5.43±2.22， P＜0.05）. No significant difference was found in the αadducin mRNA expression between the lowsalt and highsalt swbgroups in each group(P＞0.05). CONCLUSION: αadducin mRNA level in the kidney of SHR decreases abnormally with aging. Shortterm highsalt loading exerts no influence on αadducin mRNA level in the kidney of SHR.

　　【Keywords】 αadducin; hypertension; kidney; age factors

　　0引言

　　原发性高血压属于多基因遗传的复杂性疾病，遗传因素取决于染色体上的多对遗传基因，决定个体的遗传倾向，而环境因素的长期积累不仅可促使遗传倾向显示；而且可在一定程度改变遗传特性［1］. 在血压的升高机制中，肾脏无疑是中心环节，参与肾脏钠代谢的膜离子转运蛋白相关基因中内收蛋白(adducin)基因，在钠离子转运和细胞外液平衡中起重要作用［2］. 众多研究发现αadducin基因的结构改变与高血压的发生有关联，但结果也不完全一致，也未能确定αadducin基因的结构改变与盐敏感性高血压间的因果关系，我们以不同周龄自发性高血压大鼠(SHR)为动物模型，应用实时荧光定量PCR技术，研究αadducin基因表达的增龄性改变以及与高血压的关系.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　雄性SHR，分为9， 28和53 wk龄，每个年龄组随机分为正常盐组、高盐组. 高盐组含40 g/L普通加碘盐，正常盐组含9 g/L普通加碘盐，以上所有动物购于第四军医大学动物实验中心. 灯泡加热，箱内温度保持在30~35℃，将待测大鼠放置箱内加热5~10 min，使鼠尾动脉扩张，有利于准确测量. 然后根据大小将待测大鼠放置于合适的鼠笼中固定，将加压袖口置于大鼠尾根部，鼠尾远端放入光电转换器内以检测脉搏信号. 操作过程应避免粗暴抓取，当待测大鼠处于安静状态时开始测量. 两组大鼠交替测量. 每隔30 s重复测量一次，每只每天测量3次，测量3 d，取平均值. 大鼠处死后迅速取出肾脏，去除肾包膜，肾盂等结缔组织和脂肪组织后，在RNAasefree的生理盐水中迅速漂洗样品，以去除血渍和污物. 将肾脏放置冷藏管中，立即置于液氮中速冻，然后在-70℃低温冰箱中低温保存.

　　1.2方法

　　利用氯仿异丙醇提取RNA，并进行10 g/L变性琼脂糖凝胶电泳分析RNA质量，紫外光下可见28S，18S条带清楚，无DNA杂带；并用紫外分光光度计测定其纯度及质量，9，28及53 wk龄3组SHR抽提的RNA经紫外分光光度计检测A260/A280比值分别为1.979，1.956和1.996，结果证实已抽提出高纯化的总RNA. 利用Invitrogen公司 MMuLV Reverse Transcriptase将RNA反转录成cDNA.

　　以αadducin和βactin基因引物加入对应的TaqManMGB探针进行定量PCR反应，每个反应做3个复孔. 反应在96孔PCR板中进行. cDNA 1 μL用于PCR扩增，反应体系为50 μL：内含10×TaqMan缓液，MgCl23.5 mmol/L， dATP， dCTP， dGTP 200 μmol/L， dUTP 400 μmol/L， 20.8 nkat AmpliTaqGold(r)DNA多聚酶，166.7 μkat/L AmpEraseUNG， αadducin和βactin引物各200 μmol/L，探针各80 μmol/L. 配制反应混合物模板量保持一致，配制混合物充分混匀后平均分配至96孔PCR板中. 实时PCR反应在ABIprism 7700 sequence detectionsy stem完成. 反应条件：50℃ 2 min， 95℃ 10 min；然后进行50个循环. 循环条件：95℃ 30 s， 65℃ 30 s. 设定在每个循环的变性期结束后，程序自动记录上一循环最后10%时间的平均荧光值，以表示在该循环结束时的PCR产物的量. 反应完成后，得到含所有标本的记录点曲线，选择PCR baseline ubtracted(PCR基线扣除)模式进行数据分析和修正. 在调整Baselinecycles(基线循环)和计算Thresholdvalue(域值)后，计算出Ct值. Ct值含义为每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，Ct值越小样本中的起始拷贝数越高，通过外标准曲线精确计算样品的起始拷贝数. 利用荧光值曲线和Ct值就可以计算αadducin亚单位和βactin的比值，再进行各组的adducinα亚单位基因表达水平的比较. Ct值取中位数.

　　统计学处理： 计量资料均以x±s表示，应用SPSS10.0统计软件对资料进行统计分析. 计算同一样品目的基因（αadducin）和参照基因（βactin）拷贝数的比值，代表αadducin mRNA的表达水平，组间均数比较应用方差分析（oneway ANOVA）及LSDt检验，如组间方差不齐，采用非参数willoxon秩和检验. 均以P&<0.05作为有统计学意义标准.

　　2结果

　　2．1不同wk龄组SHR的体质量和血压比较 随着SHR的年龄增加，血压也逐渐升高，3组的血压有显著性差别（P&<0.05）；53 wk龄组和28 wk龄组较9 wk龄组体质量高(P&<0.05)，但53 wk龄组和28 wk龄组之间体质量无明显差别(P&>0.05，表1). 表1 9， 28和53 wk龄SHR体质量和血压的比较(略)

　　2.2盐负荷后各wk龄组SHR肾脏αadducin表达水平的比较在不同年龄组的SHR中，与正常盐组相比，高盐组SHR的血压均呈升高的趋势. 具有统计学意义(P&<0.05)，而体质量无明显增加(P&>0.05，表2）. 　计算同一样品目的基因（αadducin）和参照基因（βactin）拷贝数的比值，代表αadducin mRNA的表达水平. 28 wk龄SHR组与9wk龄SHR组相比，肾脏αadducin基因表达略有升高，但无统计学差异(P&>0.05)；而53 wk龄SHR组与9 wk， 28 wk龄SHR组相比，肾脏αadducin基因表达明显下调，有统计学差异（P&<0.05）；在9 wk龄组的SHR中，高盐组SHR和正常盐组SHR比较，肾脏αadducin基因表达有轻微上升趋势，但无显著性差异(P&>0.05) ；在28 wk龄组和53 wk龄组SHR中，正常盐组SHR和高盐组SHR的肾脏αadducin基因表达无统计学差异(P&>0.05， 表2）. 表2正常盐组和高盐组SHR的体质量血压和αadducin表达比较(略)

　　3讨论

　　原发性高血压是遗传与环境因素相互作用所致疾病. 一些基因结构异常或表达异常是高血压病的根本原因. 多项研究提示αadducin基因可能与人类部分原发性高血压相关联［3-5］. Casari等［4］提出αadducin基因可能与原发性高血压相关联. 随后Cusi等［5］研究得到类似的结果. 其进一步的病例对照研究和cDNA序列分析发现α亚单位第460位的甘氨酸(Glycine， Gly)为色氨酸(Tryptophane，Trp)取代的突变型与原发性高血压显著相关，然而， Castellano等［6］发现αadducin基因多态性与高血压无明显关联与以往有关αadducin基因变异与高血压及血压的盐敏感性的关系的研究结果不一致. 我们发现，αadducin基因在老年SHR肾脏表达较幼年和成年SHR明显降低，短期高盐摄入对于SHR肾脏αadducin基因在mRNA水平的表达无明显影响. 而以往的实验也发现在MHS中αadducin基因突变可能通过Na+K+ATP酶活性上调使肾小管钠重吸收增加进一步影响肾脏功能而导致高血压［7-8］，发现老年SHR肾脏αadducin基因表达明显下调. 我们仅研究了αadducin 基因在mRNA水平的表达，仅代表了转录水平的变化，那么从mRNA翻译为蛋白的过程中还受到多种因素的调节，且mRNA与蛋白的半衰期不同，mRNA极易降解，在组织内存在时间较短，而翻译成蛋白后性质相对稳定，因此αadducin基因在蛋白水平的表达也有可能出现不同的改变，这将在后续的实验中进一步研究.

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参考文献

　　［2］8th European Meeting on Hypertension. Milan， Italy， 1316 June， 1997. Abstracts［J］. J Hypertens (Suppl)， 1997，15(4):228.

　　［3］Ciuseppe Bianchi. Genetic variations of tubular sodium reabsorption leading to “primary” hypertension: From gene ploymorphysm to clinical symptoms［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol， 2005，289:R1536-R1549.

　　［4］Casari G， Barlassina C， Cusi D， et al. Association of the alphaadducin locus with essential hypertension ［J］. Hypertension， 1995， 25(3):320-326.

　　［5］Cusi D， Barlassina C， Azzani T， et al. Polymorphism of alphaadducin and salt sensitivity in patients with essential hypertension ［J］. Lancet， 1997， 349(9062):1353-1357.

　　［6］Castellano M， Barlassina C， Muiesan ML， et al. Alphaadducin gene polymorphism and cardiovascular phenotypes in a general population ［J］. J Hypertens， 1997，15(12Pt 2): 1707-1710.

　　［7］Tripodi G， Valtorta F， Toriello L， et al. Hypertension association pointmutation in the adducing α and β subunits affect actin cytoskeleton and iontransport ［J］. J Clin Invest， 1996， 97(12):2815-2822.

　　［8］Ferrandi M， Ferrari P， Salardi S， et al. Influence of the hypertensive related adducin polymorphism on the NaKATPase activity ［J］. J Hypertens， 1997， 15(suppl 4):S60.