关于急性脊髓挫伤性模型的制备及观察

【摘要】 目的： 制备急性挫伤型脊髓损伤动物模型.通过观察其行为学变化和脊髓组织的病理改变，为临床治疗脊髓损伤提供理论依据. 方法： 成年雌性SD大鼠，咬除T10棘突及相应椎板，用改良的Allen法制成脊髓背侧挫伤型模型，对照组仅咬除椎板，分不同的时间行为学评分和病理检测. 结果： 对照组麻醉恢复后能站立行走，脊髓结构正常;实验组行为学评分较低，脊髓损伤区域出现明显的病理改变，但随着时间的推移，可以部分的恢复. 结论： 实验组和对照组相比具有显著差异，此模型的建立为进一步了解挫伤型脊髓损伤的发病机制，研究此损伤的病理生理改变及筛选有效的预防治疗提供了良好的基础.
【关键词】 脊髓损伤；疾病模型，动物；大鼠；病理学
　　【Abstract】 AIM: To observe the functional consequence and pathological changes of spinal cord tissues in acute contusive spinal cord injury model so as to provide theoretical evidence for the clinical therapy of the impaired spinal cord. METHODS: In female adult Sprague Dawley rats， after the T10 spinous process and the corresponding vertebral lamina were removed， moderate spinal cord contusive injuries were produced by using modified Allens method in the experiment group. In control group， rats received only T10 laminectomies .The behavioral scores and the pathological alterations were recorded at different time points. RESULTS: In control group， the rats could walk after reviving， and the microstructure of spinal cord was normal.The behavioral scores of the expreriment group were lower as compared with those of the control group at different time points. The pathological alterations were very apparent in the damaged spinal cord area. When time went on， the spinal cord could be in partial functional recovery. The experimental group showed marked differences from control group. CONCLUSION: The model established in this article will contribute to understanding pathophysiological changes and screening effective therapeutic measures for this injury.
　　【Keywords】 spinal cord injuries; disease models， animal; rats; pathology
　　0引言
　　急性脊髓损伤是一种致残率很高的的疾病. 随着交通业和建筑业的迅速发展，这样的患者呈逐年上升趋势. 脊髓损伤后的病理生理机制非常复杂，人们对此认识还很不全面及深入. 由于无法依靠临床开展系统的病理学研究，通过建立动物模型进行实验研究尤为重要. 近年来， 脊髓损伤动物模型研究是热点课题， 许多学者进行了大量的研究，以求制备可靠性高、重复性好的可检测病理变化的动物模型. 本实验我们利用Allen法制备急性挫伤型动物模型，模拟临床上外伤所致的脊髓损伤，观察其行为学变化和病理改变，为后期的脊髓搜索治疗提供实验信息.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　成年雌性SD大鼠40只，体质量200~250 g， 由安徽医科大学动物实验中心提供. 动物按体质量从小到大编号，按随机数字法将这些动物等分为实验组和对照组.
　　1.2方法
　　所以动物用20 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后，俯卧位固定于解剖显微镜台板上，胸背部剃毛备皮，常规消毒，定位于T10棘突位置，以此为中心作后背部正中切口，长约3 cm，切开皮肤和皮下组织，分离两侧椎旁肌肉，用直蚊式有齿血管钳轻轻咬除T10棘突和两侧椎板至关节突，充分暴露硬脊膜，长约5 mm， T9和T11棘突分别用蚊式血管钳钳住并向两侧牵拉来固定脊髓，以T10相应区域为损伤区，后正中血管为中心，用自制改良的Allen装置制备脊髓急性挫伤动物模型.损伤力度为(10 g×2.5 cm) 25势能克厘米力(gramcm force， gcf)，然后冲洗创口，创面撒少量青霉素粉，用30号线逐层缝合椎旁肌肉和皮肤，对照组同法暴露脊髓，但不损伤脊髓. 伤后大鼠单笼饲养，自然光照，周期定时添足饲料，饮水不加限制，.每天早晚两次人工按摩膀胱排尿，直至膀胱恢复自动排尿.每2~3 d更换一次垫料，保持干燥.
　　1.3观察指标
　　1.3.1BBB运动功能评分评分采用双盲，观察者为熟悉评分标准的非本组实验人员，双人独立观察记录，最后取平均值为准. 实验动物分别在术前，术后1，2，3，4 wk进行BBB评分［1］，BBB(Basso Beattie Bresnahan)评分均在上午进行，评价前膀胱排空，观察期为4 min.BBB评分是观察动物的臀、膝、踝关节行走，躯干运动及其协调情况.
　　1.3.2组织学观察分别在伤后24 h，3 ，7 ，14 和28 d处死等量动物(n=2). 腹腔麻醉后，仰卧固定，剪开胸腔，暴露心脏，自左心室通过静脉导管快速灌注生理盐水冲洗血管，待右心耳留出液体基本无色，随即用冷的40 g/L多聚甲醛固定液灌注，量约250 mL，先快后慢，30 min后取出脊髓组织，取损伤节段和相邻节段长约0.8 cm的脊髓，4℃下将脊髓移入40 g/L多聚甲醛固定6 h，依次移入200 和300 g/L的蔗糖溶液中直至沉底，然后脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，水平面连续切片，片厚5 μm，行HE染色，光镜下观察. 另在伤后2 ，4 wk处死等量动物 (n=2)，灌注固定方法同上，将损伤节段脊髓取出后，分成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块固定于25 mL/L的戊二醛中，按常规制作步骤进行，将环氧树脂包埋的组织进行超薄切片，片厚70 nm，入枸橼酸铅染液后，在透射电镜下观察摄片.
　　统计学处理： 采用SPSS11.5统计软件包对实验数据进行组间t检验分析，数据以均数加减标准差表示，P&<0.05为有统计学意义.
　　2结果
　　2.1伤后动物基本情况观察大鼠造模苏醒后，出现双后肢不能自主活动，并明显尿潴留，肌张力低，肌力0级，显示造模成功.术后3 d内，大鼠活动较少，饮食少，体质量有所减轻，平均下降18 g左右，此后饮食逐渐恢复正常，体质量增加，活动增多.有3只大鼠术后第1日出现血尿，经过及时按压排空膀胱后，有2只大鼠小便颜色转为正常，1只大鼠(实验组)因血尿于术后第3日死亡.所有大鼠切口干燥，未见感染迹象.由于定时更换垫料，SD大鼠双后肢未见褥疮现象.经过人工按摩膀胱，5~7 d后所有大鼠基本恢复自主排尿，实验过程中，对照组1只大鼠因麻醉意外死亡.
　　2.2伤后动物行为学观察伤后动物单笼饲养4 wk，按BBB运动评分，两组受试动物各阶段评分结果见表1.表1实验组、对照组各阶段BBB运动功能评分（略）
　　2.3病理观察
　　2.3.1光镜观察假手术组组织结构致密，细胞核圆而大、染色浅、核仁清晰(图1A).实验组损伤后24 h神经元和胶质细胞几乎全部消失，白质坏死崩解，呈现“一片荒凉”景象(图1B);损伤后3 d，脊髓内斑片状出血，灰质神经元肿胀，细胞间质水肿，白质神经纤维肿胀(图1C);受伤后7 d，可出现灰质神经元肿胀，胶质细胞增生明显，间质水肿，有少量炎细胞浸润(图1D);损伤后14 d，神经纤维排列稀疏、断裂，胶质细胞增生，瘢痕形成(图1E);损伤后28 d，灰质内神经元有所恢复，间质可见大量胶质细胞形成，白质神经纤维形态逐渐恢复正常(图1F).
　　2.3.2电镜观察假手术对照组神经纤维结构正常，髓鞘完整，无分层现象(图2A).实验组，术后2 wk，髓鞘扭曲、分层和崩解，轴突内线粒体嵴突消失，空泡样变性(图2B)，神经元细胞核固缩，内质网扩张，线粒体空泡样变性，细胞膜消失(图2C);术后4 wk， 髓鞘壁变薄，部分松解，稍肿胀(图2D)，细胞膜破坏，内质网和线粒体稍肿胀(图2E)， 但较术后2 wk有明显好转.
　　3讨论
　　3.1关于模型制备本实验我们通过改良Allen法制成急性挫伤型动物模型是一种比较成熟、研究中使用最为广泛的脊髓损伤造模方法.该造模与人类脊髓损伤的性质非常相近，两者均属一定力量撞击后造成脊髓水肿、缺血，并继发一系列损伤反应脊髓损伤的典型表现.同时，该法保持了硬脊膜的完整性，可有效的防止结缔组织、组织间液、细菌或其他外源浸入脊髓损伤区.此外，该法脊髓损伤节段可以限定，撞击量可以通过重物的重量或重物下落的高度进行调控，因而有较强的可重复性. 当然，人为地造成完全等同于疾病病理过程的模型几乎是不可能的.运用A: 对照；B~F: 实验（造模后24 h，3，7，14和28 d）.
　　Allen法［2］制备良好的稳定性和可重复性急性挫伤型脊髓损伤模型，应注意: ① 动物体质量应尽量一致. ② 脊髓损伤节段及暴露范围要一致.③ 稳定脊髓以防重物撞击时引起脊髓侧向移位，导致脊髓损伤不对称.④ 撞击锤下落挫伤脊髓后，应及时移走，避免持续性压迫脊髓或多次撞击引起“反弹”损伤.
　　3.2行为学检测脊髓损伤后的运动能力评估是确定脊髓损伤程度，观察脊髓修复与再生情况及评价药物疗效的最基本的要求，所以产生了很多脊髓损伤后行为学评价方法.行为学检测是一项重要的评价措施，可以用来评价脊髓损伤后的功能变化，功能自然恢复的程度以及干预治疗的效果［1］.目前最常用的运动功能评价方法是分级为21级的较为精细详尽的BBB评分，常用来评价大鼠的运动功能.BBB评分是一种相对可靠的评价运动功能及损伤程度的方法，有利于不同机构之间学术交流及结果比较.不过，此法在实际运用中，易主观评分，导致结果失真.故常采用双盲、双人独立观察记录，最后取较低值或均值为准，或不同人分别观察两个不同后肢、最后取均值为准，致使该标准比较客观. 此外，其他常用的神经功能评定方法有Tarlov法［4］和Gale联合评分法(combine behavioral score， CBS)等［5］. Tarlov法评分跨度大，只能用于脊髓损伤后损伤程度的初步判定.CBS法虽然敏感性大为提高，但所需设备较复杂，人为因素较多，不利于推广.

　　3.3脊髓损伤后功能自行恢复虽然与周围神经系统轴突损伤后拥有良好的再生能力相比，成年哺乳动物脊髓再生能力很有限［6］. 然而，很多最近的观察发现成年哺乳动物脊髓损伤后通过内在的自我修复能力可以恢复部分功能. 这些研究认为脊髓损伤后剩余的或再生的脊髓功能归因于椎管内循环回路的自发形成或重排，这样可以部分的补偿脊髓损伤后的功能丧失［7］. 神经回路的重建的基础可能包括残存的神经元，向外生长的突起，以及脊髓损区域或附近神经回路的组织再生，不仅包括神经元，而且包括胶质细胞，特别是在中枢神经系统中调节突触发生和突触传递的星型胶质细胞［8-9］. You等［10］认为残留的4.8%的腹侧角的白质神经纤维便能对脊髓运动功能恢复发挥一定的作用. Shibuya等［11］研究发现，脊髓损伤后1 wk，胶质细胞大量增生，可能通过胶质细胞形成支架或分泌神经营养因子，促进脊髓损伤的修复.也有学者研究发现脊髓损伤能诱导内源性神经干细胞增生和分化，而促进脊髓功能的恢复［12］. 本实验发现，实验组大鼠后肢功能可以部分自行恢复，BBB评分由伤后0.47±0.70到伤后4 wk的9.92±1.12，HE染色发现伤后2 wk胶质细胞增生明显，伤后4 wk，白质神经纤维逐渐恢复正常，灰质神经元结构明显好转. 超微病理观察，术后4 wk较伤后2 wk，髓鞘结构明显好转.
　　　综上所述，利用改良WD法可制备急性挫伤型脊髓损伤模型，为进一步深入了解脊髓损伤的机理及早期的干预治疗和后期的临床治疗奠定了基础，但在评价脊髓功能恢复时，应设立严格的对照，以区分脊髓再生引起的功能恢复和残留的神经纤维代偿性功能恢复.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30571881）；安徽省自然科学基金资助项目（050430713）

参考文献

　　［1］Basso DM， Beattie MS， Bresnahan JC. Graded histological and cocomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight drop derice versus transsection ［J］. Exp Neurol， 1996，139:244-256.

　　［2］Allen AR. Surgery of experimental lesions of spinal cord equiralent to crush injury of fracture dislocation ［J］. Preliminary Report HANA， 1911，57:878-880.

　　［3］Kesslak JP， Keirstead HS. Assessment of behavior in animal models of spinal cord injury［J］. Spinal Cord Med，2003， 26(4)323-328.

　　［4］Cheng H， Cao Y， Olson I. Spinal cord repair in adult parapcegic rats: Partial restoration of hind limb fuction［J］. Science， 1996，273:510-513.

　　［5］Gale K， Kerasidis H， Wrathall R. Spinal cord contusion in the rat: Behavioral analysis of functional neurologic impairment［J］. Exp Neurol， 1985，88:123-134.

　　［6］Chen J， Leong SY， Schachner M. Differential expression of cell fate determinants in neurons and glial cells of adult mouse spinal cord after compression injury［J］. Eur J Neurosci， 2005，22:1895-1906.

　　［7］Bareyre FM， Kerschensteiner M， Raineteau O， et al. The injured spinal cord spontaneously forms a new intraspinal circuit in adult rats［J］. Nat Neurosci， 2004，7:269-277.

　　［8］Newman，EA.New roles for astrocytes: Regulation of synaptic transmission［J］. Trends Neurosci， 2003，26:536-542.

　　［9］Slezak M， Pfrieger， FW. New roles for astrocytes: Regulation of CNS synaptogenesis［J］. Trends Neurosci， 2003， 26:531-535.

　　［10］You SW，Chen BY，Liu HL，et al.Spontaneous recovery of locomotion induced by remaining fibers after spinal cord transection in adult rats［J］. Restor Neurol Neurosci， 2003，21(12): 39-45.

　　［11］Shibuya S， Miyamoto O， Itano T， et al. Temporal progressive antigen expression in radial glia after contusive spinal cord injury in adult rats［J］.Glia， 2003， 42(2): 172-183.

　　［12］Yamamoto S，Yamamoto N. Proliferation fo parenchymal neural progenitors in response to injury in the adult rat spinal core［J］. Exp Neurol， 2001， 172(1): 115-127.