黄顶菊根系分泌物对芽孢杆菌功能的影响及其主效化感物质的鉴定

本文是一篇农业论文，本研究结果 ：经黄顶菊根系分泌物二氯甲烷萃取相处理后耐寒芽孢杆菌 F60 对土壤有效磷含量影响最显著，其中邻苯二甲酸二辛酯可能是促进耐寒芽孢杆菌 F60 的主效化感物质。经黄顶菊根系分泌物二氯甲烷萃取相处理后巨大芽孢杆菌 F71 对土壤可利用氮含量影响最显著，其中邻苯二甲酸二辛酯和苯酚可能是促进巨大芽孢杆菌 F71 的主效化感物质。

第一章 绪论

1.1 植物化感作用
植物化感作用（allelopathy）是指植物通过残株落叶的腐蚀分解和根系分泌等不同途径[1]释放化学物质到环境中从而对周围植物或者微生物的生长产生直接或间接的影响[2-3]。植物化感的相关研究主要集中在化感物质的分离、鉴定、作用机理及其对农、林、牧业持续发展的应用潜力等方面，可归纳为植物与微生物间、植物种内、植物种间等化感作用机制的研究[4]。化感物质的主要成分是植物的次生代谢产物（次生代谢物），也是植物实现化感作用的主要原因。较为重要的植物化感物质大体分为 3 类：（1）酚类化合物及衍生物，通常包含酚酸、黄酮、芪类、香豆素、木质素和单宁等；（2）萜类化合物；（3）生物碱类。它们对植物的生长都产生了影响[5]。例如香豆素类[6]、生物碱[7]、低分子量有机酸[8]、酚类化合物[9]等已被多次证明具有化感作用。植物化感作用对我国农业可持续发展既有利又有弊，如黑麦的化感作用显著抑制了周围杂草的生长，减少了除草剂对环境的污染[10-11]，红薯、水稻释放化感物质在防治病虫害方面也具有重要作用[12-14]，有利于实现农业可持续发展。而芦苇的根、茎、叶等器官的乙醇提取物对 3 种植物的发育和生长都具有显著的抑制作用[15]；黄豆粗提物显著降低了菜豆（Phaseolus vulgaris）种子的萌发和幼苗生长[16]；黄顶菊植株水浸提液对绿豆[17]、旱稻[18]、小麦[19]等 29 种植物种子萌发和幼苗生长均有抑制作用[20-21]，阻碍了我国可持续发展。植物通过不同途径释放化感物质抑制周围农作物生长和发育的同时，又促进了根际有益真菌和细菌的生长和功能[22-23]。如 Badri[9]等研究证明拟南芥根系分泌物中酚类化合物主要调节土壤微生物。近几年在植物入侵领域中关于植物化感作用的研究也越来越多，部分研究表明，对中国造成严重影响的入侵植物，如紫茎泽兰[24]（Ageratina adenophora Spreng.）、豚草[25]（Ambrosia artemisiifolia）、肿柄菊[26]（Tithonia persifolia）、小飞蓬[27]（Conyza canadensis）、黄顶菊[28]（Flaveria bidentis）等都被发现对周围作物的生长有抑制作用，同时植物化感作用为探究外来植物入侵机制及其防治提供依据。
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1.2 入侵植物与土壤微生物
入侵植物的化感物质可以直接对周围的植物产生抑制作用，又可以改变土壤中碳、氮、磷等养分含量，从而营造一个对本地植物生长不利，但对自身生长有利的土壤环境，且改变土壤养分在入侵植物群落演替中的作用更加持久[29]。入侵植物与其根际土壤微生物的相互作用在入侵植物的入侵过程中起着十分重要的作用。研究表明，植物入侵程度较为严重的地区，土壤环境发生了改变[30]，并且呈现入侵的“反馈促进效应”[31-32]。如中国的典型入侵植物紫茎泽兰[23][33]、加拿大一枝黄花[34]和黄顶菊[35]均被发现可以改善入侵地土壤养分状况。LORENZO 等[36]发现，银荆（Acacia dealbata）的入侵持续的增加了土壤中碳、氮、磷的含量，有助于自身生长。入侵地土壤营养环境的变化，主要原因就是根际土壤中功能微生物的改变[37]。相关研究发现：紫茎泽兰释放的化感物质使根际土壤的有效磷含量显著提高，这正是由于促进了紫茎泽兰根际解磷细菌的生长，且入侵地土壤细菌群落特征出现了显著的变化，最终表现出对伴生植物生长的抑制和对紫茎泽兰本身的偏利作用[38-39]。宋振等[40]发现：黄顶菊根际的功能菌群随着黄顶菊的入侵发生了明显的变化，其根际固氮菌、解磷细菌和钾细菌的数量也随着黄顶菊的入侵逐渐增加。一种北美入侵植物葱芥释放的黄酮类化感物质对入侵地植物的丛枝菌根呈现更大的抑制作用，而丛枝菌根的受抑制对于本地植物的生长是不利的[41]。植物通过释放化感物质调节土壤微生物和营养状况，从而建立自身与共存植物生长的微生物群落结构和土壤营养条件[42]。这些研究都表明，植物根际的土壤微生物群落很大程度上影响着植物本身以及周围植物的生长和竞争[43]。
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第二章 根系分泌物对含有不同菌株的土壤有效磷和可利用氮含量的影响

2.1 材料与方法
2.1.1 仪器设备

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2.1.2 试验材料
供试植物为入侵植物黄顶菊，种子采自中国农业科学院植物保护研究所廊坊中试基地。
供试菌株取自从中国农业科学院植物保护研究所廊坊中试基地空白土壤中分离并鉴定出的耐寒芽孢杆菌和巨大芽孢杆菌。
供试土壤取自河北大学校园桃树下方 20-40 厘米土层，挖取的土壤过 2 毫米筛以除去土壤动物及大块石屑。
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2.2 结果与分析
2.2.1 根系分泌物对含有不同巨大芽孢杆菌和耐寒芽孢杆菌菌株的土壤有效磷含量的影响

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由表 2-3 结果可知：不添加根系分泌物时，40 个菌株对土壤有效磷含量的影响各不相同，其中添加耐寒芽孢杆菌 F122 时土壤有效磷含量最小（11.24μg/g），添加耐寒芽孢杆菌 F133 时土壤有效磷含量最大（35.9μg/g）。不同菌株经不同浓度根系分泌物处理后土壤中有效磷含量变化情况不同，总体分 4 种情况：第一组包括耐寒芽孢杆菌 F122、F5、F62、F76、F72、F3、F41、F133 和巨大芽孢杆菌 g41、g84、F71、F100、F55、F101。与对照相比，经过不同浓度根系分泌物处理后含有这些菌株土壤中有效磷含量均没有显著变化。第二组包括耐寒芽孢杆菌 F10、F130、F23 和巨大芽孢杆菌 F28、F40。与对照相比，耐寒芽孢杆菌 F10、F130 和巨大芽孢杆菌 F28、F40 在经 C1、C2 浓度根系分泌物处理后土壤有效磷含量没有显著变化，而经 C3 浓度根系分泌物处理后土壤中有效磷含量显著提高；耐寒芽孢杆菌 F23 只有经 C2 浓度根系分泌物处理后土壤中有效磷含量才显著提高。第三组包括耐寒芽孢杆菌 F68、F56、F77、F60 和巨大芽孢杆菌 g3、g4、F33、F51。与对照相比，这些菌株经C1浓度根系分泌物处理后土壤有效磷含量没有显著变化，而经 C2、C3 浓度根系分泌物处理后土壤中有效磷含量显著提高；其中巨大芽孢杆菌 F51 、耐寒芽孢杆菌 F77 和 F60 土壤中有效磷含量随着根系分泌物浓度的增加而增加。’
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第三章 不同浓度根系分泌物对耐寒芽孢杆菌解磷和巨大芽孢杆菌固氮能力的影响 · 13
3.1 材料与方法 ····························· 13
3.1.1 仪器设备 ···································· 13
3.1.2 试验材料 ····························· 13
第四章 黄顶菊根系分泌物中影响芽孢杆菌功能的主效化感物质的探究 ················ 22
4.1 材料与方法 ····························· 22
4.1.1 仪器设备 ····································· 22
4.1.2 试验材料 ·································· 22
第五章 讨论与结论 ································ 39
5.1 讨论 ························ 39
5.2 结论 ······························· 40

第四章 黄顶菊根系分泌物中影响芽孢杆菌功能的主效化感物质的探究

4.1 材料与方法
4.1.1 仪器设备 同 2.1.1
4.1.2 试验材料
供试菌株取自从中国农业科学院植物保护研究所廊坊中试基地空白土壤中分离并鉴定出的耐寒芽孢杆菌 F60 和巨大芽孢杆菌 F71。 供试土壤取自河北大学校园桃树下方 20-40 厘米土层，挖取的土壤过 2 毫米筛以除去土壤动物及大块石屑。
4.1.3 试验方法
4.1.3.1 根系分泌物的萃取与浓缩
将 2.1.3.2 保存的根系分泌物浓缩液用无菌水稀释至 500 mL，用四种极性递增的有机试剂正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇各 200 mL 于玻璃瓶中依次萃取，各有机相分别减压浓缩至干，称重。
利用气相色谱和质谱联用仪（Agilent GC7890B MS7000C，HP-5MS UI 柱 30 m×0.25 mm×0.25μm）测定黄顶菊根系分泌物二氯甲烷相组分，气相条件为进样口温度 250℃，萃取头保留 10 min，传输线温度 285℃。不分流进样，隔垫吹扫流量 3 mL/min。淬灭气为氦气，流速是 2.5 mL/min；氮气为碰撞气，流速是 1.5 mL/min。质谱条件为EI 离子源，70eV，质量扫描范围 50~500μ，离子源温度 230℃。升温程序为：

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第五章 讨论与结论

5.1 讨论
入侵我国的恶性杂草黄顶菊（F. bidentis）使我国农、林、牧业生产受到了严重的经济损失和生态灾害，因此被称为“生态杀手”[66]。在黄顶菊入侵过程中化感作用占据相当重要的地位。近年来，关于黄顶菊化感作用的研究已出现很多报道，如芦站根等[17]研究发现黄顶菊根、茎、叶水浸提液对绿豆种子均有抑制作用。代磊等[53]等研究发现黄顶菊种子浸提液使生菜、春菜、芥兰的发芽率降低，根长和茎长变短，黄顶菊茎杆浸提液抑制了小麦的茎长、叶长和根长。黄顶菊释放化感作用不仅可以直接作用于邻近作物，还可以通过改变根际土壤微生物的功能进而改变根际土壤养分。如纪巧凤[67]等研究表明黄顶菊的入侵丰富了群落多样性，改变了根际土壤中磷细菌的群落，使优势种群更加明显。祁小旭[68]也发现黄顶菊显著影响了其入侵地的土壤理化性质。陈学林等[69]发现随着入侵的加剧, 外来植物红毛草（Rhynchelytrum repens）土壤与氮代谢循环相关微生物群落发生了显著变化。
土壤中能够活化养分的微生物有很多种，其中芽孢杆菌是植物根际促生菌（PGPR）中重要的一大类群，既可以将土壤中难利用的磷转变为可以被植物吸收利用的有效磷，又可自生固氮，促进植物生长，起到活化土壤养分的作用，并且实验室前期研究表明巨大芽孢杆菌和耐寒芽孢杆菌是黄顶菊的根际优势菌。为探究黄顶菊根系分泌物对巨大芽孢杆菌和耐寒芽孢杆菌功能的影响，本试验开展进一步研究。研究结果表明黄顶菊根系释放的化感物质会影响巨大芽孢杆菌和耐寒芽孢杆菌的解磷固氮能力，从而改变土壤有效磷含量和可利用氮含量。
植物化感物质往往含有多种组分。然而黄顶菊根系分泌物中对芽孢杆菌起促进作用的主效化感组分尚不清楚。本研究对黄顶菊根系分泌物潜在活性化感物质进行追踪分离，得到黄顶菊根系分泌物中促进巨大芽孢杆菌和耐寒芽孢杆菌功能和生长的活性化感物质，并初步确定为酯类化合物邻苯二甲酸二辛酯和酚类化合物苯酚对巨大芽孢杆菌 F71的固氮能力和生长有显著的促进作用。酯类化合物邻苯二甲酸二辛酯对耐寒芽孢杆菌F60 的解磷能力和生长有显著的促进作用。有关黄顶菊的这两个天然化合物，在其化感作用方面己有一些研究和报道，如番茄[70]、黄花蒿[71]、地黄根系分泌物[72]中均被鉴定出了邻苯二甲酸二辛脂，并且李佳华[73]等研究表明邻苯二甲酸二丁酯污染影响了苦草的生理生化指标；商闫[74]研究发现黄顶菊根系分泌物可以抑制附近生长的萝卜、玉米、黄瓜和小麦植株种子的萌发以及株高和生物量，并在黄顶菊根系分泌物中鉴定出邻苯二甲酸二辛酯为化感物质。李玲娟[75]等研究发现，植物所分泌的酚酸类化感物质是通过改变根际土壤中微生物的群落结构而影响了氮素的转化，Adele Muscolo[76]也通过研究发现酚酸类化合物是一种在植物中广泛存在以碳为基础的次生代谢物，在土壤-植物-环境相互作用中起着重要作用。但黄顶菊根系分泌物二氯甲烷萃取相中其它化合物是否对芽孢杆菌有促进作用尚不明确，有待进行进一步研究。
参考文献（略）