医学角度重组跨膜肽-人表皮生长因子融合蛋白在毕赤酵母中的表达

本文是一篇医学毕业论文，本实验正确构建了 TAT-hEGF 毕赤酵母工程菌；初步建立了TAT-hEGF 的毕赤酵母高效表达体系。通过凝胶过滤层析及离子交换层析，纯化融合蛋白 TAT-hEGF。同时通过细胞的促增殖实验，证明了所制备的重组TAT-hEGF 融合蛋白具有明显的促细胞增殖的生物活性，为开展后续的动物实验及应用奠定了基础。

第 1 章 绪论

1.1 EGF 研究进展
1.1.1 EGF 概述
表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)是一类普遍存在于人类多种腺体及体液中且具备生物活性的多肽，参与调节机体多种细胞的增殖、迁移、分化等重要的生物学过程。
1962 年，Cohen 等分离纯化小鼠颌下腺中神经生长因子时，意外获得的一种多肽可以促进初龄小鼠门齿的萌出、眼睑睁开程度及抑制小鼠毛发生长，将其命名为“齿睑因子(Tooth-Lid Factor)”，后体内外研究显示，此种多肽具有促进多种表皮细胞增殖及组织再生的作用，1972 年 Savage 等提纯并发表了此肽完整53 个氨基酸序列组成，改称表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)。Gregory 等首次从人尿中分离出人表皮细胞生长因子（human Epidermal GrowthFactor, hEGF），具有抑制胃酸分泌作用，故早期称为尿胃抑素（urogastrone，UG）。后继研究发现尿胃抑素与人表皮细胞生长因子是同一种物质，因此统一命名为人表皮生长因子并沿用至今。EGF 可从多种哺乳动物中分离提取，且序列高度相近、功能相似。
伴随对 EGF 的深入研究，目前已广泛开发应用于临床疾病的医治，如眼角膜损伤、皮肤烧伤和创伤、手术切口及外伤愈合等。另外 EGF 作为生物工程产品应用于美容护肤产品中，成为医学生物技术渗透美容业的典型开端，在细胞及分子水平上解决美容护肤问题，加快皮肤新陈代谢的速度，延缓衰老，为广大爱美女性带来科技的福音。
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1.2 CPPs
细胞膜具有天然屏障作用，一方面使细胞保障稳定代谢的胞内环境，另一方面可以调节和选择物质出入细胞。细胞膜由磷脂双分子层构成内部是疏水性的非极性分子，因此使得非脂溶性物质及生物大分子如多肽、蛋白质、DNA 不能实现自由穿越细胞膜进行物质和信息交流。在分子水平上可以诊断治疗大多数疾病，但由于细胞膜的屏障作用，使具有治疗价值的体外生物活性大分子药物不能进入细胞内发挥作用。近年来研究者发现一类短肽能自发穿过细胞膜，并且可携带生物大分子进入细胞，具备较强的跨膜转运能力，即细胞跨膜肽（CellPenetrating Peptides, CPPs），也称蛋白转导域（Protein Transduction Domain，PTD），或特洛伊木马肽（Trojan horse peptides）。CPPs 是一类由 10-30个氨基酸组成的短肽，此类肽对细胞膜不会产生永久性损伤，无刺激性，在一定浓度范围内对宿主细胞无毒害作用，能传递生物活性物质进入细胞从而发挥生物学活性产生治疗作用，因此作为一种新型的药物运载工具备受青睐。
1.2.1 CPPs 的种类与结构特点
自然界中细胞跨膜肽的发现源于 1988 年，Green 等研究发现 HIV-1 肽段上编码的反式激活蛋白 TAT（Trans-activating transcriptional activator，TAT），自身可以跨膜进入细胞，反式激活 HIV-1 启动子，对病毒基因表达至关重要。其碱性氨基酸富集区含有 11 个氨基酸（YGRKKRRQRRR），包括 6 个精氨酸和 2 个赖氨酸，Vives 等的研究揭示这 11 个氨基酸是跨膜转导的核心区。长期研究发现，TAT 可介导包括多肽、蛋白质及核酸等外源生物大分子安全有效地进入细胞，甚至可以通过血脑屏障到达脑组织发挥作用，与此同时保持其生物活性。
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第 2 章 材料和方法

2.1 实验材料
2.1.1 仪器与设备

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2.2 方法
2.2.1 pPICZαA-TAT-hEGF 真核表达载体的构建
2.2.1.1 TAT-hEGF 基因序列合成
本文设计的 TAT-hEGF 融合基因，是在不改变原有氨基酸序列的前提下，将编码 TAT-hEGF 氨基酸的密码子完全转变成毕赤酵母偏爱密码子，并且在序列 5’端引入 XhoⅠ酶切位点和 Kex2 特异性氨基酸识别位点序列，在目的基因编码序列的 3’端设计有终止密码子和 XbaⅠ酶切位点。由上海生工合成，合成的目的基因被克隆于 pUCK 载体中。设计序列如下：


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第 3 章 实验结果 .......................27
3.1 目的基因片段的获取 .................27
3.1.1 pUCK-TAT-hEGF 的提取 ..................27
3.1.2 TAT-hEGF 基因片段的获取.............27
第 4 章 讨论..............38
第 5 章 结论...............41

第 4 章 讨论
利用基因工程表达外源蛋白已经成为一种理想、成熟的技术手段。最早应用于外源基因表达的体系是原核表达系统，其中大肠杆菌表达系统应用最早、最为广泛，大肠杆菌表达体系与其它表达系统相比，繁殖能力强大，在充足的营养条件下，生长周期短；且大肠杆菌对培养基要求不高，若大规模发酵时可大大降低成本，生产潜力巨大，因而大肠杆菌表达系统在基因表达技术中占有重要地位。但大肠杆菌表达系统也存在缺陷：
（1）原核细胞内不具备后期蛋白质的加工修饰功能，如蛋白的糖基化等，蛋白不能形成正确的空间构象，使得表达产物活性小或失去活性，因此该系统只适合部分蛋白的表达。
（2）纯化目的蛋白时，需破碎大肠杆菌细胞壁释放目的蛋白，但与此同时宿主菌株自身所产生的内毒素及热源等物质一同释放，使纯化目的蛋白的难度增加，而且其自身产生的内毒素和热源也很难去除。
（3）表达蛋白多以包涵体形式存在，必须经过变性、复性等处理。复性过程影响蛋白质生物学活性、降低目的蛋白的产量。
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第 5 章 结论
1．利用人工合成的方法将编码 TAT-hEGF 氨基酸的遗传密码子全部转换成毕赤酵母偏爱密码子，并在 5’端设计 XhoⅠ酶切位点和 Kex2 特异性氨基酸识别位点，在 3’端加上终止密码子 TAA 和 XbaⅠ酶切位点。用 XhoⅠ和 XbaⅠ酶切pPICZαA 载体后与上述合成的基因片段连接，成功构建了 pPICZαA-TAT-hEGF真核表达载体。
2．电转化毕赤酵母 X-33 感受态细胞，经 PCR 鉴定，证明目的基因 TAT-hEGF已整合入酵母染色体中。甲醇诱导表达后，筛选获得高表达目的蛋白 TAT-hEGF的毕赤酵母工程菌。
3．以筛选出的高表达毕赤酵母工程菌为基础，摸索出最佳发酵条件：最佳pH 值为 4.6，目的蛋白 TAT-hEGF 的表达随时间的增加而升高，在诱导第 1 天即开始有所表达，第 6 天表达量最高，可达约 0.6mg/mL。
4．摇瓶诱导表达的蛋白上清液通过等电点沉淀、40%饱和硫酸铵盐析初步分离浓缩目的蛋白，进而通过弱阳离子交换层析，使用 30mmol/L 醋酸-醋酸钠（PH5.2）缓冲液含300mmol/L的NaCl成功获得纯化的重组融合蛋白TAT-hEGF。
5． 通过 NIH/3T3 细胞检测我们所制备的融合蛋白 TAT-hEGF，具有明显的促进细胞增殖的生物活性。
参考文献（略）