第一章 引言
1.1 传染性支气管炎概述
冠状病毒感染家畜、家禽、宠物和人，是非常重要的病毒性病原体之一。该病毒属套式病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒属（Coronavirus）(Drexler et al., 2010)。国际病毒学分类委员会将冠状病毒分为四型，包括 α 型、β 型、γ 型以及 δ 型四种。α 型冠状病毒包括猪流行性腹泻病毒（PEDV）、人冠状病毒（HCoV-229E）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、犬冠状病毒（CCoV）以及猫冠状病毒（FCoV）等。β 型冠状病毒包括我们所知道的严重急性呼吸综合征病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）、人冠状病毒（HCoV-HKU1）、鼠冠状病毒、家蝠冠状病毒（Co V-HKU5）、牛冠状病毒（BCoV）、马冠状病毒（ECoV）、猪血凝性脑脊髓炎病毒（PHEV）以及犬呼吸道型冠状病（CrCoV）等，其中所提到的鼠冠状病毒主要包含以下几类：鼠肝炎病毒 MHV、大鼠冠状病毒 RCV 以及鸟嘴海雀病毒（Puffin osis coronavirus），其中鼠肝炎病毒是我们常见的冠状病毒之一(Cottam et al., 2011)。上述所说的 α 型和 β 型冠状病毒主要是通过感染哺乳动物传播疾病，常涉及到人类、家畜以及宠物等各个种群，在世界范围内分布极其广泛，给人类生产和生活带来危害，造成巨大的经济损失。γ 型冠状病毒则主要感染禽鸟类动物，在 1937 年发现的禽传染性支气管炎病毒，即 IBV （Avian infectious bronchitis virus），是其中的代表性病毒 (Chu et al., 2007)。δ 型冠状病毒于 2009 年被发现，依据冠状病毒的基因遗传进化分析结果，在 2011 年被正式划分为第四种冠状病毒，主要包括夜莺冠状病毒（HKU11）、鹅口疮冠状病毒（HKU12）、猪流行性腹泻病毒 (PDCoV) 等(Brian and Baric, 2005)。δ 型冠状病毒基因组特征与其他类型的冠状病毒属也存在较大的差异 (Luo et al., 2016)。其中 PDCoV 与猪病毒性腹泻疫情密切相关，是目前常见的危害规模化养猪场的重要病原体之一，给养猪业造成了巨大的经济损失
禽传染性支气管炎（Avian infectious bronchitis, IB）由禽传染性支气管炎病毒 IBV 感染引起，造成鸡群的急性、高度接触性的传染性疾病，属于禽类的四大疾病之一，给养禽业带来了巨大的经济损失 (Cavanagh, 2007)。在兽医临床上按照其症状的不同，将其划分为不同的类型，分别是常见的呼吸型、肾型、腺胃型以及较少发生的生殖型。该病毒病一年四季均发，尤以秋冬、春初季节交替时期最为严重；鸡群是该病毒的自然宿主，并且各个日龄的鸡群均易感染该病毒，尤其是 1-4 周龄最为严重。
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1.2 传染性支气管炎病毒的生活史
1.2.1 吸附
S 蛋白受体的特异性是决定病毒宿主特异性和嗜性的重要因素。S 蛋白与宿主细胞表面受体相结合, 标志着冠状病毒的感染周期的开始(Li, 2016)。因此 S 蛋白在病毒感染中具有决定性的作用(Lontok et al., 2004)。α 型冠状病毒对膜结合金属肽酶有一定的选择作用，不少 α 型冠状病毒的受体是氨肽酶 N（APN）(Miguel et al., 2002)；β 型冠状病毒的受体范围比 α 型冠状病毒更加广泛，例如 MHV 能够利用抗原-细胞黏附分子(CEACAMs)与细胞表面相结合，该类分子是属于 Ig 超家族的一组糖蛋白分子；而 γ 型冠状病毒的细胞受体尚不清楚 (Dveksler et al., 1991)。当病毒与细胞表面受体发生结合，细胞内蛋白酶剪切 S 蛋白为 S1 和 S2，，暴露出 S2 内部的融合肽序列，然后插入到细胞膜中，S2 蛋白发生构象变化，形成六螺旋束，拉近病毒囊膜和宿主的膜,发生膜融合 (Helenius, 2018) (Li, 2016)。受体结合过程如图 1.2 所示。
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第二章 UPS 促进冠状病毒的复制
2.1 实验材料
2.1.1 病毒、病毒抗体和细胞
本实验所用的 IBV-beaudette 株，anit-IBV-N、anti-IBV-S、anti-IBV-Nsp3 抗体以及 Vero 细胞由华南农业大学刘定祥实验室赠予，PEDV 毒株由本实验室保存。鸡成纤维细胞系 DF-1、人肺癌细胞系 H1299 和非洲绿猴肾细胞 Vero 购于 ATCC（American Type Culture Collection）并由本实验室保存，DF-1 和 Vero 细胞培养于含有 10%胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基，H1299 细胞培养于含有 10%胎牛血清（FBS）的 RPMI 1640 培养基，培养条件为 37℃，5% CO2无菌培养箱。
2.1.2 主要试剂
二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）购自西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich）；MG132、硼替佐米（Bortezomib）、Epoxomicin 购自 Selleck 公司；TRIzol 购自赛默飞公司； Anti-β-actin、HRP 标记的羊抗鼠和羊抗兔的二抗购自 CST 公司；SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液和 DAPI 染色液购自中国碧云天公司；RPMI 1640 培养基和 DMEM 培养基购自 Hyclone 公司；胎牛血清 FBS 购自Gibco 公司；lumiQ 通用型 ECL 发光液和 Super 超敏型 ECL 发光液购自圣尔生物公司；WST 细胞增殖检测试剂盒购自碧云天公司。
2.1.3 主要仪器
本研究用到的仪器有：Microfuge16 微量台式离心机（美国 Beckman 公司）；Allegra X-30R台式冷冻离心机（美国 Beckman 公司）；EPS 600 电泳仪（上海天能公司）；Cellometer Auro1000细胞计数仪（美国 Nexcelom bioscience 公司）；HF100 二氧化碳培养箱（中国力康公司）；Tanon 5200全自动化学发光图像分析系统（上海天能公司）。
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2.2 实验方法
2.2.1 IBV 感染细胞实验
将细胞计数，并按照 1×106/孔的细胞数接种至六孔板。24 小时后，取其中一个孔，胰酶消化后计细胞数确定病毒的 MOI。PBS 清洗六孔板三遍。每孔加入 1 ml 稀释于无血清培养基的病毒液（MOI=1）。六孔板放置在 37℃，5%CO2细胞培养箱 1 小时，取出并弃去病毒液，用预冷的 PBS清洗三遍，然后更换成无血清的培养基继续进行培养。对照组 mock 不感染病毒，其他操作均与感染组一致。在感染后不同时间点,按照实验方案收取感染细胞样品。
2.2.2 细胞上清和蛋白样品的收集
收取蛋白样品时，弃去上清（在需要检测病毒 TCID50的实验中，收集上清），然后用预冷的PBS 清洗细胞三遍，弃去 PBS 后，每孔加入 200 μl 1×SDS 蛋白上样缓冲液裂解细胞，转移至 EP管，金属浴或者水浴 100℃ 5 分钟，12000× rpm 离心 5 分钟，取上清液用于 SDS-PAGE。
2.2.3 RNA 抽提和 RT-PCR
（1）往六孔板细胞的每孔加入 1ml（使用无 RNA 酶的枪头） TRIzol 试剂，上下左右晃动，使其裂解均匀，然后室温静置 5 分钟，待细胞完全裂解后，将裂解液转移至无 RNA 酶 EP 管中（震荡 5-10 秒，使其充分裂解）；
（2）待震荡充分裂解后，再向 EP 管中加入 200 μl（使用无 RNA 酶的枪头）氯仿，其目的是为了将有机相与无机相迅速分离，从而使蛋白与 RNA 脱离，RNA 进入水相。盖紧盖后震荡 15秒左右，室温静置 5-10 分钟；
（3）将 4℃离心机提前预冷，然后将样品放入，
12000×rpm/分钟，4℃离心 15 分钟后，轻轻取出，将上层水相转移到新的无 RNA 酶 EP 管中，再加入等量异丙醇，-20℃沉淀 1 小时或者更长时间。
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3.1 实验材料 .................................. 21
3.1.1 病毒、病毒抗体和细胞 .............................. 21
3.1.2 主要试剂 .................................. 21
第四章 相关蛋白的泛素化促进 IBV 入胞 ....................................... 26
4.1 实验材料 ............................................. 26
4.1.1 病毒、病毒抗体和细胞 .......................................... 26
4.1.2 主要试剂 .................................................. 26
第五章 全文结论 ............................. 32
第四章 相关蛋白的泛素化促进 IBV 入胞
4.1 实验材料
4.1.1 病毒、病毒抗体和细胞
pCMV-HA、HA-Ubiquitin 质粒均由本实验室构建保存；Anti-Ubiquitin 抗体购自 CST 公司；其他同 2.1.1。
4.1.2 主要试剂
PYR-41 购自 selleck 公司, FuGENE 转染试剂购自 Promega 公司，其他试剂同 2.1.2。
4.1.3 主要仪器
同 2.1.3。
通过查阅文献及根据本实验室以前数据，用培养基将 PYR-41 稀释成 2μM、4μM、8μM、10μM备用，然后分别加入到感染 IBV 的 Vero 细胞六孔板中，感染后 12 小时收样，Western Blot 检测细胞内泛素化蛋白的累积情况和病毒蛋白的表达。
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第五章 全文结论
5.1 IBV 的感染和增殖需要利用 UPS 系统
5.2. UPS 在 IBV 内吞之后和基因组起始翻译之前发挥作用，主要是影响病毒的胞内运输、膜融合和脱壳过程
5.3 IBV 入胞需要相关蛋白的泛素化修饰。
参考文献（略）