前言
对印记基因的分离鉴定及作用机制的研究表明，许多与印记基因和印记控制中心邻近的序列存在DNA甲基化修饰及差异甲基化序列，在差异甲基化区域内来自父母本的等位基因甲基化水平不同。例如，当印记基因来自父源，则父源等位基因发生高度甲基化而母源等位基因不发生甲基化或发生低甲基化，这样就使得转录因子或其他转录相关蛋白与其结合能力有所不同，进而使双亲等位基因的表达能力不同，即产生了印记，而母源印记基因则恰恰与此相反。
.............
材料与方法
1材料
DNA 扩增仪（GeneAmpPCRSysyerm9700; ABI；美国）
实时焚光定量 PCR 仪（Real-Time-PCR System Mx3000P; Strata gene；美国）
紫外可见分光光度计（Ultrospec 4300pro; GE Healthcare；英国）
超净工作台（FLC-3型；哈尔滨市东联公司；哈尔滨）
超纯水装置（SZ-93;上海雅蓉生化仪器厂；上海）
旋润混合器（QL-901;麒麟医用仪器厂；江苏）
手提式压力蒸汽消毒器（GMSX-280;北京市永光明医疗仪器厂；北京）
精密电子天平（OHAUS)台式离心机（TGL-16B;上海安亭科学仪器厂；上海）
恒温水浴箱.(CS501，;上海卓绝仪器设备有限公司）
高速低温台式离心机（2-16K; SIGMA；美国）
2方法
据相关文献报道[7-10]，人类H19基因是位于染色体llpl5.5区域印记基因簇中的1个父源印记基因，即父源等位基因甲基化而不能被甲基化敏感限制性内切酶切割,母源等位基因未甲基化而能被甲基化敏感性限制性内切切割。本课题对文献已报道?的父源印记基因H19上游区域进行研究，由文献获得引物对AB和CD,引物对AB包含4个Hhal酶切位点和VNTR位点，扩增长度1.7kb左右。引物对CD只包含VNTR位点，扩增长度500bp左右。实时定量PCR引物对EF来自本实验室，扩增长度147bp。引物序列见表1。(1)破坏红细胞。400nl抗凝血加中加入ImlTKMl和50nlNP40，震荡混勾后，13000rpm离心5min，弃去上清，细胞沉淀中再用TKM1液体悬浮，混勾后离心，重复数次至上清变为无色为止。(2)破坏白细胞：上述处理的样品加TKI也500^11，20mg/mlPK3nl混匀后于56°C水浴箱中孵育-5小时，至液体完全透明。(3)—次等体积苯酷，一次苯酷/氯仿，一次氯仿抽提。每次抽提需要小心水相和油相充分混匀，13000rpm离心5min,尽量将水相转移至另一离心管中。(4)向上清中加2.5倍体积的冰无水乙醇同时加入1/10体积的3M醋酸钠，混勾后在-2(rC沉淀1小时，14000rpm20min，弃上清，加入3倍体积75%无水乙醇，14000rpm20inin，弃去上清液，空气干燥，加适量的去离子水溶解，-20°C保存备用。
结果1...........2
1. Chelex-100提取法提取的DNA作为Hha I酶切底物应用于印记基因H19上游区域差异甲基化检测的结果............12
2印记基因H19上游区域YNTR基因座在山西汉族人群中多态性研究结果.....15
讨论........18
1Chelex-100法提取DNA的定量............18
2Chelex-100提取DNA作为Hha I酶切底物用于印记基因H19上游区域差异甲基化的检测...........18
结论.............22
讨论
1Chelex-100法提取DNA的定量
在本实验中，需要适量DNA作为甲基化敏感限制性内切酶Hhal的底物，通过对酹氯仿法提取DNA作为Hha I酶切底物量的摸索,在反应总体积为20-11，HhaI(NEB)为30U37°C消化15小时条件下，底物量选取15ng酶切效果最佳。因此实验中Chelex-100法提取的DNA酶切底物量取15ng。由于Chelex-100法提取的DNA不能用紫外分光光度法直接定量，因此采用已知拷贝数的标准品作为对照，用实时定量PCR法定量。
2Chelex-100提取DNA作为Hha I酶切底物用于印记基因H19上游区域差异甲基化旳检测
DNA甲基化作为表观遗传学的重要研究内容之一是蛋白质和核酸的一种重要修饰，与生长发育、衰老、癌症以及许多疾病密切相关其一直就是遗传学、肿瘤学、法医学等学科重点研究内容之一。以甲基化敏感限制性内切酶为基础的分析方法是甲基化检测中常用的方法之一，它具有实验结果易解释、成本低廉、对操作者要求不高及可同时研究基因组内多个甲基化位点等优点[2]。甲基化敏感限制性内切酶法主要采用消化后PCR技术，目前用该方法的DNA底物大多是用齡氯仿法提取的DNA。酌氯仿法提取DNA的优点是DNA纯度高，_量多，但对检材起始量的要求比较高，实验周期长且方法繁琐，复杂，难以满足法医实际工作中快速、简便、微量检材的要求。相比于粉氯仿法，Chelex-100法提取DNA简便、快速，适用于微量检材，因此在法医的实际工作中得到广泛应用。法医实际工作中用Chelex-100法提取DNA —般用于PCR反应，DNA聚合酶除具有耐高温的特性外，其他性质与生物_相类似。DNA聚合酶在Chelex-100法提取的DNA中工作效率比较高，扩增效果好。生物酶催化生物反应都需要合适的温度，PH值，辅助因子等，比较TaKaRa公司DNA聚合酶与NEB公司甲基化敏感限制性内切酶Hha I反应所需要的反应缓冲液的组成，前者由MgCh、KCK Tris-HCl组成，后者由Mg(Ac)2、KAc、Tris-Ac、DTT组成，两者成份类似，这为Chdex-100法提取DNA作为甲基化敏感限制性内切酶Hha I酶切底物应用于印记基因H19上游区域差异甲基化检测提供了可能。
.........
结论
(1)Chelex-100法提取的DNA能成为甲基化敏感限制性内切酶Hha I酶切底物应用于印记基因H19上游区域差异甲基化的检测，Hhal消化后PCR扩增两条条带光密度比值在3.63—4.13区间时可分辨父源或母源的遗传多态性条带。(2)印记基因H19上游区域VNTR基因座在山西汉族人群中具有高度遗传多态性，可用于法医学个体识别和亲权鉴定。
..........
参考文献（略）