芪归健脑颗粒对老年性痴呆大鼠学习记忆及脑组织nNOS、COX2蛋白表达的影响

　　　　　　作者：姜波， 严妍， 吴娟，周忠光

【摘要】 目的： 观察芪归健脑颗粒对老年性痴呆(AD)大鼠学习记忆能力的保护作用，并探讨其作用机制。方法： Wistar雄性大鼠70只，随机分为7组，每组10只，即芪归健脑颗粒高剂量组、芪归健脑颗粒中剂量组、芪归健脑颗粒低剂量组、吡拉西坦组、模型组、假手术组与正常组，采用海马区注射Aβ40溶液制作AD大鼠模型。各组大鼠在造模后第7天开始给药治疗，正常组、假手术组与模型组大鼠给予等容积生理盐水，连续21天。观察AD大鼠学习记忆能力，并用免疫组化法检测脑组织中氧化亚氮合酶(nNOS)和环氧化酶2(COX2)蛋白表达的影响。结果： 芪归健脑颗粒能明显缩短Aβ40所致AD模型大鼠的潜伏期，增加穿越平台的次数，显著降低AD模型大鼠海马COX2阳性表达，提高nNOS 阳性表达。结论： 芪归健脑颗粒对Aβ40所致AD模型大鼠学习记忆障碍具有明显的改善作用，其机制可能是芪归健脑颗粒通过COX2，nNOS等信号转导途径，减轻Aβ40毒性作用所致脑组织神经元损伤，从而改善学习记忆障碍，起到防治AD的作用。

【关键词】 芪归健脑颗粒; 阿尔茨海默病; 学习记忆; 氧化亚氮合酶; 环氧化酶2

　　[Abstract] Objective: To observe the protection of qigui jiannao granule for learning and remembering of AD rats， and approach the mechanism of action.Methods： pided seven groups with seventy Wistar masculinity rats at random， and ten rats every team. Modeling AD rats with Aβ40 by hippocampus injection. After seven days， qigui jiannao granule were administered to AD rats， and lasted twentyone days. Observed learning and remembering of AD rats， and used immunohistochemical method to detect the expression of COX2 and nNOS in hippocampus. Results： Qigui jiannao granule can obviously shorten the latency of AD rats caused by Aβ40 and increase the frequency of passing through platform. It decreased the masculine expression of COX2 and increased the masculine expression of nNOS. Conclusion： Qigui jiannao granule might lessen brain tissue neuron damage and improve the learning and remembering of AD rats caused by Aβ40 by signal transduction pathway of COX2 and nNOS.

　　[Key words] qigui jiannao granule; Alzheimer′s disease ;learning and remembering;nNOS;COX2

　　老年性痴呆又称阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)，是一种病因不明的原发性中枢神经系统进行性、退行性疾病，是老年人的多发病和常见病。本课题通过实验研究，初步探讨芪归健脑颗粒的药理作用机制，为防治老年性痴呆的临床应用提供佐证，也为今后的新药开发奠定基础。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组

　　12月龄Wistar雄性大鼠70只，体质量(530±20) g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为芪归健脑颗粒高剂量组(5.6 g/kg)、芪归健脑颗粒中剂量组(2.8 g/kg)、芪归健脑颗粒低剂量组(1.4 g/kg)、吡拉西坦组(100 mg/kg)、模型组、假手术组和正常组。

　　1.2 实验药物与仪器

　　芪归健脑颗粒由黄芪、当归尾、赤芍、地龙、川芎等组成，由黑龙江中医药大学制剂室提供;吡拉西坦片，400 mg/片，东北制药厂生产。Aβ40、兔抗nNOS和羊抗COX2试剂盒及DAB均购自北京中山生物技术有限公司;PBS、4%低聚甲醛;大鼠脑立体定位仪(SN2日本);Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)。

　　1.3 动物模型复制

　　水迷宫测试筛选48 h后，参考包新民等[1]《大鼠脑立体定位图谱》，给模型组大鼠的海马区缓慢注射已配好的Aβ40溶液2 μl(10 μg)，缝合皮肤并消毒，防止感染。假手术组注入等量无菌双蒸水，正常组不作处理，其余各组同模型组。

　　1.4 给药方法

　　各组大鼠在造模后第7天开始口服灌胃给药治疗，2 ml/200 g大鼠，正常组、假手术组与模型组大鼠给予等容积生理盐水，每日1次，连续21天。

　　1.5 观察指标

　　1.5.1 定位航行实验 用于测量大鼠对水迷宫的学习能力。历时5天，从第1天起，每天分上、下午各训练1次。训练时随机选择一个入水点，将大鼠面向池壁放入水中，记录大鼠寻找并爬上平台所需时间(潜伏期)，每次训练时间为60秒。

　　1.5.2 空间搜索实验 用于测量大鼠学会寻找平台后对平台空间位置记忆的能力，即在第6天撤除水下平台，随机选取一个入水点，在同一入水点将大鼠面向池壁放入水中，记录其在60秒内跨过原平台相应位置的次数和第一次通过平台的时间。

　　1.5.3 蛋白表达检测 按照文献[2，3]制备脑组织标本。免疫组织化学SP法检测脑组织中COX2，nNOS表达，免疫组化法按试剂盒说明书操作，计算观察区域内的免疫组化染色阳性细胞数。

　　1.6 统计学处理

　　各组数据以均数±标准差(±s)表示。多组均数间相互比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用q检验。两组间比较采用t检验。统计学处理用SPSS10.0统计软件包进行，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 芪归健脑颗粒对AD大鼠潜伏期的影响

　　术前各组大鼠潜伏期差异无统计学意义(P&>0.05)。术后第7天，正常组和假手术组的潜伏期与术前比较差异无统计学意义(P&>0.05);其余各组潜伏期较术前各组明显延长，大鼠发生了认知功能的下降，各治疗组与正常组和假手术组结果比较，差异有统计学意义(P&<0.01)。

　　治疗后第28天，模型组与正常组比较，差异有统计学意义(P&<0.01);正常组和假手术组的潜伏期与术前比较差异无统计学意义(P&>0.05);模型组潜伏期仍明显较前两组延长，说明模型组认知功能仍然较差;而芪归健脑颗粒高、中、低剂量组和吡拉西坦组大鼠潜伏期较术后第7天明显下降，且与模型组相比，差异有统计学意义(P&<0.01)。说明各组大鼠经过治疗后，认识功能有所提高;芪归健脑颗粒高、中、低剂量组与吡拉西坦组大鼠潜伏期比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。结果见表1。表1 芪归健脑颗粒对各组大鼠潜伏期的影响

　　2.2 芪归健脑颗粒对不同时期AD大鼠穿越平台次数的影响

　　术前各组大鼠穿越平台次数比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。术后第7天，正常组和假手术组穿越平台次数与术前比较差异无统计学意义(P&>0.05)，而其余各组较术前明显减少，与前两组比较差异有统计学意义(P&<0.01)。

　　治疗后第28天，正常组和假手术组大鼠穿越平台的次数与术前比较差异无统计学意义(P&>0.05);模型组明显较前两组降低，差异有统计学意义(P&<0.01)，说明模型组认知功能仍然较差。而芪归健脑颗粒高、中、低剂量组和吡拉西坦组大鼠穿越平台的次数较术后第7天明显提高，且与模型组相比，差异有统计学意义(P&<0.01)。说明各组大鼠经过治疗后，认知功能有所提高;芪归健脑颗粒高、中、低剂量组与吡拉西坦组大鼠穿越平台次数比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。结果见表2。表2 不同时期各组大鼠穿越平台的次数

　　2.3 芪归健脑颗粒对AD大鼠COX2，nNOS蛋白表达的影响

　　COX2免疫反应阳性物质呈棕黄色，定位于细胞的胞膜。阳性细胞在正常组和假手术组的海马区均有弱表达;在模型组反应强度明显高于正常组和假手术组，与前两组比较，差异有统计学意义(P&<0.01);芪归健脑颗粒高、中、低剂量组和吡拉西坦组COX2免疫反应强度明显减弱，阳性细胞数减少，与模型组相比，差异有统计学意义(P&<0.05或P&<0.01);与正常组相比较，反应强度变化不太明显，但阳性细胞数还是较高，其中芪归健脑颗粒低剂量组与正常组比较，差异有统计学意义(P&<0.05);芪归健脑颗粒高、中、低剂量组和吡拉西坦组各组间比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。

　　模型组nNOS反应强度明显低于正常组和假手术组，与前两组比较，差异有统计学意义(P&<0.01);而且细胞着色很浅;芪归健脑颗粒高、中、低剂量组和吡拉西坦组nNOS的表达近似于正常，而且细胞着色较深，与模型组相比，差异有统计学意义(P&<0.05或P&<0.01);芪归健脑颗粒高、中、低剂量组和吡拉西坦组各组间比较，差异无统计学意义(P&>0.05)。结果见表3。表3 芪归健脑颗粒对各组大鼠COX2，nNOS表达的影响

　　3 讨 论

　　学习和记忆水平体现了脑的高级整合功能，认识学习是记忆的神经基础，改善学习记忆能力一直是神经科学的研究热点之一。老年性痴呆在临床上主要表现为进行性记忆和后天获得知识能力丧失，学习记忆水平是老年性痴呆的诊断和疗效评价指标中最重要的因素，所以行为学实验已成为诊断和评价老年性痴呆的重要手段。在本课题研究中，芪归健脑颗粒对Aβ40所致AD模型大鼠学习记忆障碍具有明显改善作用。

　　COX是催化花生四烯酸产生前列腺素(prostaglandins，PGs)的限速酶，在人体内主要存在COX1(结构型) 和COX2(诱导型)2种亚型。COX1呈原生性表达，定位于内质网，促进生理性PGs的合成，维持和调节组织细胞正常的生理活动，保持自身稳定，在炎症时表达无明显改变[4]。COX2呈诱导型表达，在生长因子、细胞因子、炎症介质、激素等刺激因素作用下，表达迅速上调，其催化产生的PGs在炎症反应中发挥重要作用。研究显示长期慢性炎症或其他因素作用下COX2持续表达则有促进血管生成，抑制细胞凋亡作用。NOS是催化产生内源性NO的唯一酶类，并因NO的非囊泡释放、高度弥散和半衰期极短等特征而在很大程度上决定着NO的生物学效应。NO是一种神经递质，与学习和记忆有着密切关系，在神经系统中具有重要的作用[5]。正常浓度的NO起着生理性的信息传递作用，而高浓度的NO主要表现为细胞毒性作用，导致神经细胞坏死。在本课题研究中，芪归健脑颗粒可显著降低Aβ40所致AD模型大鼠海马COX2阳性表达，提高nNOS阳性表达，从而改善学习记忆障碍，起到防治老年性痴呆的作用。

参考文献

　　[1] 包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱[M].北京：人民卫生出版社，1991：30-34.

　　[2] 徐淑云.药理实验方法学[M].北京：人民卫生出版社，1995.

　　[3] Murphy PG， Grondin J， Altares M， et al. Induction of interleukin6 in axotomized sensory neurons[J].J Neurosci，1995， 15(7 Pt 2)：5130-5138.

　　[4] 韩玉生，周忠光.补阳还五汤对Aβ40所致老年性痴呆大鼠海马区β淀粉样前体蛋白及相关基因表达的影响[J].时珍国医国药，2009，20(1)：9-11.

　　[5] 邱幸凡，袁德培，王 平，等.醒脑益智方对老年性痴呆模型大鼠大脑皮质及海马区nNOS表达的影响[J].河南中医，2006，26(4)：29-30.