人RORγt mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

　　 作者：王海生 王胜军 崔大伟 陈建国 柳迎昭　杨先知 史烨 田洁 仝佳 许化溪

【摘要】 目的： 建立检测人RORγt(retinoidrelated orphan receptor gammat) mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR， qRTPCR)方法。方法： 根据人RORγt mRNA的保守序列设计特异性引物，提取经PMA和离子霉素刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)总RNA，并逆转录成cDNA，与pMD18T载体连接构建质粒标准品。采用qRTPCR方法检测RORγt mRNA水平，并评价该方法的线性、特异性及重复性。应用该方法检测Graves病(Graves′ disease， GD)患者外周血中RORγt mRNA的相对表达。结果： 该方法标准曲线的相关系数为0.998，融解曲线分析显示单个峰，pMD18TRORγt质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为6.5%，8.4%和9.6%，11.2%。初步研究表明GD患者组RORγt mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(t=-3.72， P&<0.01)。结论： 建立的检测人RORγt mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异且重复性好，为临床应用提供了实验基础。

【关键词】 RORγt; 实时定量PCR; SYBR GreenⅠ

　　[Abstract] Objective: To establish a SYBR GreenⅠrealtime fluorescent quantitative PCR(qRTPCR) method for the detection of human RORγt(retinoidrelated orphan receptor gammat) mRNA.Methods： The specific primers were designed according to the conserved sequence of human RORγt mRNA.Total RNA was extracted from human peripheral blood mononuclear cells(PBMC) stimulated by PMA and ionomycin， and was transcribed reversely into cDNA.The RORγt gene was obtained by PCR and cloned into PMD18 vector by TA clone technology.The linearity， specificity and repeatability of the method were evaluated.The relative expression level of human RORγt mRNA in PBMCs from patients with GD was detected by this method. Results： The coefficient of correlation of the standard curve of this method was 0.998， melting curve was single peak， and the CVs in intra and interassay were 6.5%， 8.4% and 9.6%， 11.2% in high and low copies plasmid standards respectively.The relative expression level of human RORγt mRNA in GD group was higher markedly than that in healthy control group(t=-3.72， P&<0.01). Conclusion： qRTPCR was a sensitive， specific and repeatable method for the detection of human RORγt mRNA， and this method serves as a technologic base for clinical application.

　　[Key words] retinoidrelated orphan receptor gamma t; realtime quantitative PCR; SYBR GreenⅠ

　　RORγt(retinoidrelated orphan receptor gamma t)基因是RORC的一种剪接变异体，最初因主要表达在CD4+CD8+胸腺细胞而得名[1]。近期研究表明Th17细胞在炎症反应及自身免疫病等疾病中发挥了重要作用，RORγt作为Th17细胞特异性转录因子可诱导IL17A，IL17F等因子的表达[2]。本文建立了一种检测人RORγt基因的实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR， qRTPCR)方法，并初步应用于Graves病患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PBMC)中RORγt mRNA的检测，为研究Th17细胞的分化和功能提供实验手段。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 研究对象 GD患者组22例，男5例，女17例，平均年龄(31.4±9.4)岁，均为在江苏大学附属人民医院就诊的经临床症状和实验室检查符合GD诊断标准的初诊患者。健康对照组18例，男5例，女13例，平均年龄(29.6±6.1)岁，无其他急慢性疾病。

　　1.1.2 主要试剂和仪器 Ficoll淋巴细胞分离液(天津灏洋生物技术有限公司)，RPMI1640培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，PMA，Ionomycin(Sigma公司)，Trizol(Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(ToYoBo有限公司)，rTaq酶、dNTP，10×缓冲液，pMD18T，EcoRⅠ，SalⅠ(TakaRa公司)，SYBR Green Ⅰ Real Time PCR Kit(杭州BIOER公司)，Rotor Gene RG 6000荧光定量PCR仪(澳大利亚Corbett公司)，pMD18Tβ肌动蛋白质粒由本实验室构建并保存[3]。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 引物设计及合成 利用Premer Premier 5.0软件根据NCBI基因库中RORγt mRNA保守序列设计PCR引物，并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，其中RORγt：上游5′CCTGGGCTCCTCGCCTGACC3′;下游5′TCTCTCTGCCCTCAGCCTTGCC3′;扩增片段169 bp。β肌动蛋白：上游5′CACGAAACTACCTTCAACTCC3′;下游5′CATACTCCTGCTTGCTGATC3′;扩增片段262 bp[3]。

　　1.2.2 样本处理 取外周静脉血5 ml经肝素抗凝后，利用淋巴细胞分离液分离PBMC，然后用RPMI 1640培养基(含终浓度为50 ng/ml PMA和终浓度为1 μg/ml离子霉素)调整细胞密度为1×106/ml，取1 ml放入24孔板，于5%CO2，37℃刺激培养，5 h后收集细胞，向其中加入1 ml Trizol试剂裂解细胞，提取总RNA。用逆转录试剂盒以Oligo(dT)20将总RNA逆转成cDNA。反应条件为：42℃，20 min;99℃，5 min;4℃，5 min。合成的cDNA于-80℃冰箱保存备用。

　　1.2.3 pMD18TRORγt重组质粒的构建 以上述制备的cDNA为模板，利用PCR扩增RORγt片段。反应条件：94℃预变性5 min;94℃，30 s;65℃，30 s;72℃，30 s;35个循环;72℃，7 min。将PCR产物与pMD18T载体进行TA克隆，经EcoRⅠ酶切，EcoRⅠ和SalⅠ双酶切及PCR鉴定，阳性克隆送上海英骏公司测序，证实与NCBI 基因库中RORγt基因序列完全一致。阳性克隆菌株通过LB培养基扩增，抽提并纯化质粒，将纯化质粒稀释成(103～108)copies/μl作为标准品于-20℃冰箱保存备用。

　　1.2.4 标准曲线的制备 以稀释的标准品作为模板在荧光定量PCR仪上进行扩增，制备标准曲线。为避免引物二聚体的干扰，扩增时采用四步法，即：94℃预变性5 min;94℃，30 s;65℃(RORγt)/56℃(β肌动蛋白)30 s;72℃，30 s;87℃(RORγt)/86℃(β肌动蛋白)8 s;扩增35(RORγt)/30(β肌动蛋白)个循环。扩增结束后由仪器内置软件绘制标准曲线和融解曲线。

　　1.2.5 特异性的评价 将标准品及部分临床标本cDNA的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析该方法的特异性。

　　1.2.6 重复性的分析 以pMD18TRORγt质粒标准品相对低拷贝数(104copies/μl)和相对高拷贝数(107copies/μl)在批内和批间均重复检测10次作为重复性实验，获取各自的变异系数。

　　1.2.7 样本RORγt mRNA相对表达量的检测 将样本cDNA、标准品、空白对照、阴性对照及RNA对照按照上述反应体系和反应条件同时进行扩增，根据标准曲线分别检测每个样本的RORγt和β肌动蛋白 mRNA copies/μl，最后，以β肌动蛋白为参照校准RORγt的相对表达。

　　1.2.8 统计学分析 利用SPSS12.0软件进行统计分析。各组数据以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用两样本t检验。以P&<0.05为有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 qRTPCR检测人RORγt mRNA方法学的建立

　　2.1.1 pMD18TRORγt重组质粒的鉴定 pMD18TRORγt TA克隆质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，可见2 653 bp大片段和208 bp小片段，同时经PCR扩增出169 bp的片段(图1)。后经测序鉴定与RORγt基因序列完全一致，从而证实pMD18TRORγt阳性质粒构建成功。

　　M1：TakaRa 250bp 标准参照物; 1：pMD18TRORγt EcoRⅠ酶切; 2：pMD18TRORγt EcoRⅠ和SalⅠ酶切; 3：pMD18TRORγt质粒PCR产物; M2：TakaRa DL2000 DNA 标准参照物

　　2.1.2 qRTPCR检测RORγt mRNA的标准曲线和融解曲线 将上述构建成功的pMD18TRORγt阳性质粒稀释成(103～108)copies/μl作为模板制备标准曲线和融解曲线。其中，标准曲线如图2a所示，相关系数(R2)为0.998;斜率(M)为-3.442。融解曲线如图2b所示，只有单个融解曲线峰。

　　2.1.3 qRTPCR检测RORγt mRNA方法的特异性 为了检验该方法的特异性，我们将制备标准曲线的质粒标准品和部分临床标本cDNA的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。从图3中可以看出只有RORγt目的基因条带而无其他任何条带。

　　2.1.4 qRTPCR检测RORγt mRNA方法的重复性 pMD18TRORγt质粒标准品相对低拷贝数(104copies/μl)批内和批间变异系数分别为9.6%和11.2%;pMD18TRORγt质粒标准品相对高拷贝数(107copies/μl)批内和批间变异系数分别为6.5%和8.4%

　　2.2 GD患者外周血RORγt mRNA相对表达水平的检测

　　RORγt mRNA的相对表达水平以RORγt/β肌动蛋白 mRNA比值表示。GD患者组和健康对照的比值分别为0.030±0.127和0.019±0.006，两者比较，差异有统计学意义(t=-3.72， P&<0.01)。

　　3 讨 论

　　RORγt是核激素受体家族成员之一，目前，尽管其配体未知，但相关的研究业已表明它是Th17细胞特异性转录因子，主要诱导IL17的表达。由于IL17受体分布广泛，故而IL17能作用于许多类型细胞(如内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞等)，诱导众多的细胞因子(如IL6、TNFα、粒单细胞集落刺激因子、粒细胞刺激因子等)和趋化因子(如IL8、CXC趋化因子配体1、CC趋化因子配体20等)的表达[4-5]。这些细胞因子、趋化因子活化诱导中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞等，使之浸润到炎症部位，一方面消除胞外细菌和真菌，保护机体避免炎症损伤，如发现IL17受体缺陷的小鼠更容易遭受肺部细菌感染，其原因与中性粒细胞浸润到肺部的数量减少有关[6];另一方面这些细胞可能导致慢性炎症和自身免疫性疾病，如在类风湿性关节炎患者关节滑膜液中的IL17通过刺激滑膜细胞表达肝细胞生长因子等血管因子，促进血管翳的生成，破坏关节组织[7]。

　　GD是一种器官特异性自身免疫性疾病，其具体的致病机制还未阐明，近年细胞因子在GD发病中的作用受到重视。有研究表明在GD患者未治疗时，血清中IL6表达明显增加，经治疗缓解后，IL6下降至正常水平，且IL6水平与甲状腺激素明显相关[8];TNFα与其受体参与GD中甲状腺功能损坏的细胞毒性过程[9]。本研究中，我们发现Graves病患者外周血中RORγt mRNA的表达明显高于健康对照组(P&<0.01)，这提示GD患者体内可能存在着Th17细胞的极化及IL17，IL6，TNFα等细胞因子表达增强的现象，因此，本研究为探究GD的致病机制及治疗手段提供了新的思路。

　　本研究建立了一种检测人RORγt mRNA的qRTPCR方法。在pMD18TRORγt质粒标准品为(103～108)copies/μl范围内，该方法标准曲线的相关系数为0.998，说明该方法的线性较好;斜率为-3.442，该方法的扩增效率达0.98。同时，该方法的融解曲线呈单个峰，经琼脂糖凝胶电泳分析，只有目的基因而无引物二聚体等非特异性扩增产物，说明该方法的特异性较好。另外，该方法的重复性分析显示：批内和批间的变异系数均在可接受的范围内。因此，本研究建立的检测人RORγt mRNA的qRTPCR方法特异、灵敏且重复性好，能够准确检测RORγt mRNA的含量，从而为进一步的临床检测提供实验基础。

参考文献

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　　[2] Ivanov II， McKenzie BS， Zhou L， et al.The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL17+T helper cells[J].Cell， 2006，126(6): 1121-1133.

　　[3] 吴 蔚，王胜军，李遇梅，等.皮肌炎患者外周血CD4+T细胞中TGFβ1mRNA表达及意义[J].江苏大学学报:医学版， 2008， 18(3): 255-257.

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　　[9] Díez JJ， Hernanz A， Medina S， et al.Serum concentrations of tumor necrosis factoralpha(TNFalpha) and soluble TNFalpha receptor p55 in patients with hypothyroidism and hyperthyroidism before and after normalization of thyroid function[J].Clin Endocrinol(Oxf)， 2002，57(4): 515-521.