不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞生物学特性的影响

　　　　 作者：居会祥， 戴真煜， 孙明忠， 吕晶晶

【摘要】 　　目的： 研究不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞增殖、凋亡的影响。方法： 采用共沉淀法制备得到不同粒径FeOx，将不同粒径FeOx吸附于细胞表面，并加载静磁场(SMF)及100 Hz交变磁场(EMF)照射。运用CCK8检测纳米粒子吸附后在外加磁场作用下Bel7402细胞增殖情况，运用流式细胞仪检测细胞凋亡、死亡率及细胞周期变化。结果： 不同粒径磁性纳米FeOx在SMF照射时间低于72 h时能使Bel7402细胞增殖速度增快，当照射时间大于72 h时，细胞增殖速度未发生明显变化但部分细胞发生凋亡，凋亡率为(3.1±0.78)％。而经EMF照射后37 nm FeOx吸附细胞增殖被抑制，细胞周期实验结果表明大部分细胞被阻滞在G0/G1期，细胞出现大量死亡与凋亡，凋亡率达到(23.34±3.6)％、死亡率达到(57.24±2.7)％。结论： 纳米粒子未有外加磁场照射时不能对细胞产生明显的影响，外加SMF照射时，细胞的增殖及DNA代谢未发生明显的变化，但细胞发生凋亡；外加EMF照射时，细胞增殖被抑制并发生明显的凋亡及死亡，细胞DNA代谢明显紊乱，且具有较小粒径的磁性纳米FeOx在EMF作用下对肝癌细胞影响最为显著。

【关键词】 磁性纳米FeOx； 增殖； 凋亡； DNA周期
　
　　［Abstract］Objective: To study the effects of different diameters of nano FeOx powders on proliferation and DNA metabolism of heptomacell lines Bel7402.Methods： Different diameters of nano FeOx powders were utilized to dope the heptomacell lines Bel7402 through the coprecipitation meanings， then cells were exposed by static magnetic field(SMF) and extremely low frequency altering magnetic field(EMF) with 100 Hz. After exposed by external fields， CCK8 kit was used to detect the effects on proliferation of cells caused by nano powders. Apoptosis kit and DNA cycle kit was used to detect the effects caused by nano FeOx of cell apoptosis， death and cell DNA cycle metabolism. Results： Different diameters nano FeOx could not influence the cell at all under SMF exposure but could influence the cells under EMF， when the diameter was 37 nm the highest apoptosis and death ration were (23.34±3.6)％ and (57.24±2.7)%， respectively， and the most of cells were prohibited in G0/G1 period of DNA cycle. Conclusion： nano powders could not influence the cells at all without external magnetic field exposure. Under SMF exposure the proliferation and DNA metabolism of cells absorbing by nano powders were not influenced， but the apoptosis ratio of cells was increased. After exposure by EMF cells absorbing by nano powders could be affected in proliferation， apoptosis and DNA metabolism，furthermore， all the effects were more obvious in the cells absorbing by nano powders with little diameter under EMF exposure.

　　［Key words］magnetic nano FeOx； proliferation； apoptosis； DNA cycle

　　磁性纳米材料具有良好的磁导向性、较好的生物相容性、生物降解性和活性能基团等特点［1-3］，它可结合各种功能分子，如酶、抗体、细胞、DNA或RNA等，因而在靶向药物、控制释放、酶的固定化、免疫测定、DNA和细胞的分离与分类等领域可望有广泛的应用。磁性纳米材料特别是Fe属纳米颗粒已经被广泛应用于药物靶向治疗及干细胞定向移植治疗中［4］。当粒径在30～200 nm之间时，矫顽力和饱和磁化强度均达到最大值，且具有单畴特性。目前已有纳米磁性氧化铁等颗粒作为药物或干细胞载体用于肝癌动物实验的研究，但对磁性纳米氧化铁粒子本体对人体研究相对较少［5］。本研究以肝癌细胞Bel7402为对象，观察不同粒径磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对其生物学特性的影响，旨在为FeOx用于治疗肝癌提供实验依据。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 试剂及仪器
　　
　　肝癌细胞株Bel7402购自中国科学院上海细胞库。静磁场发生仪为两块强磁场稀有金属镍/铁永磁体，当两块磁体间距为2.5 cm时其场强为0.7特斯拉（T）。TYU2002H II型特斯拉计/高斯计为上海亨通磁电科技有限公司产品。变频仪(FT1000型)为南京万臣电子有限公司产品，变压器(PT800型)为上海富济电子公司产品。胰蛋白酶、Primilar1640培养基、胎牛血清(FBS)购自Gibco公司，二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，维生素C、青霉素、链霉素为杭州四季青公司产品。CCK8试剂盒为美国ADL公司产品，细胞凋亡及周期试剂盒均购自美国BD公司。FeSO4、醋酸锌均为分析纯，购自南京化学试剂有限公司。扫描电镜(SEM)型号为HITACHIX650，X射线衍射仪(XRD)型号为Philips X′pert XRD system型。
　　
　　1.2 方法

　　1.2.1 磁性纳米FeOx的制备

　　运用共沉淀法［5］以FeSO4及醋酸锌为反应物，反应在乙醇、水（1∶3）混合溶剂中进行并加入质量百分比为2％的甘油，制备得到醋酸亚铁前驱体，前驱体粉末灼烧温度为400℃，灼烧4 h后得到FeOx粉体，10 000 r/min离心30 min，得到上下两层不同粒径粉末，经SEM及XRD实验确定其粒径及成分组成。SEM实验前样品用超声清洗仪超声分散10 min。XRD实验条件为：扫描速率为2θ/min，测定纳米粉体XRD谱。

　　1.2.2 磁性纳米FeOx吸附细胞实验

　　将不同粒径纳米FeOx加入到细胞培养瓶中与细胞共同培养。纳米粒子吸附细胞方法为：将细胞消化成细胞悬液并调整细胞浓度大于105个/ml，再将不同粒径纳米粒子加入到细胞悬液中并在恒温摇床中匀速振荡30 min，摇床摇速为200 r/min。振荡完成后将细胞置于细胞培养箱中培养。细胞培养2 d后经SEM实验确定磁性纳米FeOx结合效率。

　　1.2.3 细胞培养

　　细胞种植到含10％FBS PIMIRIER 1640培养基的培养瓶，放置在37℃，5％CO2培养箱持续培养。细胞传代时用胰蛋白酶消化细胞成细胞悬液，磷酸盐缓冲液（PBS）1 500 r/min 15 min离心洗涤2次，用含10％FBS 1640培养基重悬细胞后种植细胞，每次细胞种植浓度应大于105个/ml。细胞临时保存在-70℃超低温冰箱，永久保存在液氮罐中，细胞冻存液配比为DMEM∶FBS∶DMSO=7∶2∶1(体积比)，细胞冻存浓度应高于106个/ml。

　　1.2.4 磁场照射细胞方法

　　静磁场(SMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于两块永磁体之中，同时置于细胞培养箱中培养，每间隔12 h照射1次，每次照射30 min，直至84 h。100 Hz交变磁场(EMF)照射细胞方法为：将细胞培养瓶置于离工作线圈顶端2 cm，经特斯拉计测量磁感应强度为0.67 mT，每间隔4 h照射1次，每次照射30 min，直至40 h。照射完成后，细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液进行各种检测。

　　1.2.5 CCK8细胞增殖实验

　　按试剂盒提供实验方法进行。首先取出96孔酶标板，依照次序对应分别加入50 μl的标准品于酶标板微孔中，分别标记样品编号，将50 μl细胞培养悬液（2.5×104个/ml）加入到酶标板中；在标准孔和样品孔中加入100 μl的酶标记液，36℃孵育1 h，将溶液倾出， PBS清洗5次后每孔加入底物A，B液各50 μl，36℃下避光孵育反应15 min后加入终止液50 μl，终止反应。测定450 nm的光密度值。每隔12 h重复进行以上步骤，72 h得到细胞增殖数据绘制细胞增殖曲线。

　　1.2.6 细胞凋亡、死亡及周期实验

　　细胞凋亡及周期实验均在流式细胞仪上完成，均按试剂盒提供实验方法进行。凋亡实验方法为：将细胞用胰蛋白酶消化成细胞悬液，并用PBS洗涤2次并将细胞浓度重悬调整为106个/ml。染色过程为首先用微量移液枪移取20 μl细胞悬液，然后用AnnexinV加入到细胞悬液中并避光静置15 min后将PI染料加入并静置30 min，染色完成后上机实验。细胞周期实验方法为：首先按凋亡实验相同方法处理细胞以待上机检测，染色方法为将试剂盒内A，B，C，D 4种试剂按顺序分别加入到细胞悬液中，避光静置时间均为15 min。染色完成后上机实验。流式细胞仪实验条件为：细胞进样流速中速，前向角补偿电势为56 V。

　　1.2.7 统计分析

　　实验结果用±s表示，使用SPSS13.0软件进行统计分析，采用单因素方差分析，以α=0.05为检验水准。

　　2 结果
　　
　　2.1 纳米FeOx表征实验结果
　　
　　SEM及XRD实验结果表明两种粒子的平均粒径分别为37，70 nm左右，粒子形状为不规则球形（图1，2）。根据Scherrer 公式：D=Kλ/βcosθ，其中D为粒子粒径，K为形状因子，λ为X 衍射的波长，β为衍射峰的半峰宽，θ为衍射角。经XRD实验结果证明粒子中Fe，O两种元素的比例为1∶1.12。图3为2种FeOx与Bel7402细胞吸附情况，图中FeOx为黑色颗粒，FeOx与Bel7402细胞发生了较为明显的吸附，37 nm粒子更易于在细胞表面吸附，表现为每个细胞表面吸附粒子数量明显增加。
　　
　　(a)37 nmFeOx(×30 000倍）(b)70 nmFeOx(×10 000倍)

　　2.2 细胞增殖实验结果
　　
　　不同粒径纳米FeOx在未经磁场照射时并未对细胞增殖产生明显的影响，细胞经SMF照射其增殖在磁场照射初期速度变快，当照射时间超过72 h后增殖未发生明显改变(相对对照组)。 经EMF照射后两种粒子吸附细胞的增殖均被抑制，当EMF照射时间为5 h时细胞增殖抑制率达到最大，37nm FeOx抑制率达到（76.31±2.3）％，70 nm FeOx抑制率为（53.56±5.2）％。

　　2.3 细胞凋亡及死亡实验结果
　　
　　从表1可见，凋亡率、死亡率3组间比较差异无统计学意义，说明未经磁场照射的纳米粒子不能导致细胞死亡及凋亡。表2可见37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射达到60 h后，细胞发生凋亡，当照射时间为72 h时37 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（3.13±0.78）％，70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率仅为（1.25±0.23）％。而未经磁场照射37nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.03）％，70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.02±0.04）％，未经FeOx吸附细胞的凋亡率为（0.01±0.02）％。表1 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然生长凋亡率及死亡率，Tab 1 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表2 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射细胞凋亡率及死亡率，Tab 2 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。
　　
　　表3表明随着EMF照射时间的延长，细胞凋亡率随之增加，当照射时间达到5 h时其凋亡率最大，37 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（23.34±3.6）％，死亡率（57.24±2.7）％。而70 nm FeOx吸附细胞的凋亡率为（12.54±6.7）％，死亡率为（37.28±4.2）％。当照射时间超过5 h后，细胞凋亡率增速变慢。表3 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经EMF照射凋亡率及死亡率，Tab 3 Apoptosis and death ration of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）

　　2.4 细胞周期实验结果
　　
　　从表4可见，37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然生长细胞周期，与未经处理Bel7402细胞作比较，无统计学意义，与凋亡实验结果相符，表明FeOx吸附细胞并不能影响细胞周期代谢。表5表明当细胞被纳米粒子吸附并在外加SMF照射下细胞DNA代谢未发生紊乱，在SMF照射初期细胞处于S，G1期细胞比例增加，细胞增殖变快，与细胞增殖实验结果吻合，当照射时间超过72 h后细胞处于G0期含量增加，细胞进入增殖静止期。凋亡实验结果表明此时细胞发生明显的凋亡，表明细胞凋亡通路被激活，细胞增殖可能被抑制。表4 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞自然增殖细胞周期实验结果，Tab 4 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx（略）；表5 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经SMF照射细胞周期实验结果，Tab 5 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by SMF（略）。
　　
　　表6表明，37 nm和70 nm FeOx吸附细胞在外加EMF作用下，细胞DNA代谢均发生明显变化，细胞周期中G0/G1值增加， 照射5 h时37 nm粒子吸附细胞值为（91.6±1.3）％，而70 nm粒子吸附细胞值为（63.5±2.4）％，细胞增殖被抑制。表6 37 nm和70 nm FeOx吸附细胞经EMF照射细胞周期实验结果，Tab 6 Proliferation results of Bel7402 absorbed by different diameters nano FeOx exposed by EMF（略）。
　　
　　3 讨论
　　
　　磁性纳米材料已经被用作药物或干细胞的载体用于各种疾病的靶向治疗［6］，但现有研究多集中于纳米粒子与药物或干细胞的吸附研究，对磁性纳米粒子本体在外加磁场作用下对细胞或生物体影响的研究较少，本研究即以磁性纳米FeOx在外加磁场作用下对肝癌细胞Bel7402的影响为研究对象。
　　
　　我们采用共沉淀法制备得到的纳米FeOx粒子的平均粒径分别为37 nm及70 nm且粒径分布均匀。粒子形状为不规则球形，XRD实验结果表明粒子的表面有较多的空间位隙，导致粒子中两种元素的化学计量比不规则，其Fe与O计量比为1∶1.12。已有研究表明具有晶格缺陷的纳米粒子更容易吸附小分子物质或更容易吸附在其他物质表面［7］，本文合成得到的纳米粒子具有较多的晶格缺陷，实验用纳米FeOx较易在细胞表面发生吸附。
　　
　　细胞增殖实验表明，37 nm和70 nm FeOx吸附在细胞表面后在SMF照射条件下，细胞增殖速度在照射初始阶段增加，当照射时间超过72 h后细胞发生凋亡，但增殖速度未发现明显变化，可能由于FeOx吸附细胞后在SMF照射条件下更易沉降到细胞培养瓶底部。纳米FeOx并不能影响细胞的正常分裂与增殖，同时SMF照射细胞也不能引起细胞发生改变，与文献报道结果类似［8］。EMF照射细胞能抑制细胞增殖，细胞增殖时间明显延长，当EMF照射时间达到5 h后，EMF照射FeOx吸附细胞抑制达到最大。比较两种FeOx吸附细胞在EMF照射条件下细胞增殖结果可以得出，37 nm FeOx粒子对细胞的增殖抑制更为显著，表明纳米FeOx在EMF照射下能很好地抑制肝癌细胞的增殖。
　　
　　EMF照射细胞本身能影响细胞的增殖，导致细胞早期凋亡以及细胞DNA代谢发生紊乱和DNA双链断裂［9］。本研究表明，纳米粒子吸附到细胞表面后在外加EMF作用条件下这种影响更为明显，具有更小粒径的FeOx在EMF作用下对细胞凋亡的影响更为显著。同时，随着EMF照射时间增加，FeOx吸附的细胞DNA代谢发生紊乱，大部分细胞被阻滞在G0/G1期，同时处于S期的细胞含量减少，表现为明显的S期和G2 期阻滞。
　　
　　纳米粒子在吸附到细胞表面后可一定限度地改变细胞表面电势，EMF同样能改变细胞表面的电势而导致细胞发生凋亡等生理现象［9，10］。两种外加因素对细胞的影响有明显的叠加效果，纳米FeOx在外加EMF作用下发生明显的振荡现象能较大程度改变细胞膜表面的电势分布，从而改变Na+，K+，Ca2+等离子通过细胞膜表面的速度和方向，Ca2+代谢与细胞的凋亡相关，Na+，K+与细胞死亡和DNA代谢相关［10］。同时，纳米FeOx在磁场作用下发生振荡能导致明显的热效应［11］，导致细胞发生凋亡或死亡以及导致细胞DNA发生明显的代谢紊乱。37 nm FeOx在外加EMF作用下对Bel7402的影响更为明显，在EMF作用下振荡更为剧烈［12］。
　　
　　综上所述，不同粒径磁性纳米FeOx吸附在细胞表面并不能影响细胞的增殖，也不能导致细胞发生凋亡或DNA代谢紊乱；在SMF照射时，在磁场照射初期能提高吸附有纳米粒子的细胞增殖速率，当照射时间达到72 h时能导致细胞发生凋亡；在EMF照射时，吸附有纳米FeOx细胞的凋亡及死亡率急剧变大，表明磁性纳米粒子与EMF对细胞的作用有叠加效果，具有较小粒径的纳米FeOx在EMF作用下对细胞的影响更为剧烈。磁性纳米FeOx在外加EMF作用下能很好地抑制细胞的增殖。对纳米粒子在细胞表面的吸附率、与细胞的融合以及对细胞膜表面电势的影响及热效应还需进行更为深入的研究。

参考文献

　　［1］Xu J， Yang HB， Fu WY. Preparation and magnetic properties of magnetic nanoparticles by solgel method［J］. J Magn Magn Mater， 2007， 309(1): 307-311.

　　［2］Viota JL，Durán JDG， GonzálezCaballero F， et al. Magnetic properties of extremely bimodal magnetite suspensions［J］. J Magn Magn Mater， 2007， 314(2): 80-86.

　　［3］Hong RY， Pan TT， Han YP， et al， Magnetic field synthesis of Fe3O4 nanoparticles used as a precursor of ferrofluids［J］. J Magn Magn Mater， 2007， 310(3): 37-47.

　　［4］Carpenter EE. Iron nanoparticles as potential magnetic carriers［J］. J Magn Magn Mater， 2001， 225(1): 17-20.

　　［5］Qu YQ， Yang HB， Yang N， et al.The effect of reaction temperature on the particle size， structure and magnetic properties of coprecipitated CoFe2O4 nanoparticles［J］. Mater Lett， 2006， 60(29/30): 3548-3552.

　　［6］David R， Peter A， Eric D， et al. Dermatan carriers for neovascular transport targeting， deep tumor penetration and improved therapy［J］. J Contro Rel， 2005， 109(1/3): 222-235.

　　［7］Yoshitsugu K， Yasuaki K， Tetsuya H. Magnesiumbased nanocomposite materials for hydrogen storage［J］. J All Com， 2006， 424(1/2): 294-298.

　　［8］Li F， Xu KW， Wang HC， et al. Effects of static magnetic field on human umbilical vessel endothelial cell［J］. J Med Colle PLA， 2007， 22(2): 106-110.

　　［9］阮晓声，梁中庆，张月芳，等.恒磁场环境对大鼠血液流变学特性的影响［J］.中华理疗杂志，2000，23(4): 218.

　　［10］Koelsch P， Viswanath P， Motschmanna H， et al. Specific ion effects in physicochemical and biological systems:Simulations， theory and experiments［J］. Colloids Sur A， 2007，303（1/2）: 110-136.

　　［11］Balcavage WX， Alvager T， Swez J， et al. A mechanism for action of extremely low frequency electromagnetic fields on biological systems［J］.Biochem and Biophy Res Comm， 1996， 222(2): 374-378.

　　［12］Hana L， Reba G. Electric and magnetic noise blocks the 60 Hz magnetic field enhancement of steady state cmyc transcript levels in human leukemia cells［J］. Bioelectro and Bioenerg， 1995， 36(1): 33-37.