霍乱弧菌致病因子诱导人肠上皮细胞炎症反应的实验研究

【摘要】 　　目的： 鉴定诱导人肠上皮细胞炎性反应的霍乱弧菌分泌产物。方法： 野生型霍乱弧菌O1株C6706及其变异株培养上清刺激极化的人单层肠上皮T84细胞体外模型上层腔面，分析细胞受刺激后通透性和细胞活性以及白细胞介素8(IL8)、肿瘤坏死因子α(TNFα)基因表达改变；分析上清中霍乱弧菌蛋白酶(Vibrio cholerae protease，PrtV)和霍乱弧菌溶细胞素(Vibrio cholera cytolysin，VCC)含量以及溶血能力。结果： PrtV缺失株培养上清可引起T84细胞层的炎性反应，表现为通透性增加和IL8，TNFα基因表达增加。肠上皮细胞炎性反应及红细胞溶血反应与VCC活性有关。结论： VCC是霍乱弧菌引起人肠上皮细胞炎性反应的主要因素，PrtV通过降解VCC而降低对肠上皮细胞的炎性反应。

【关键词】 霍乱弧菌蛋白酶； 霍乱弧菌溶细胞素； 人单层肠上皮细胞； 炎性反应

　　［Abstract］Objective: To identify the secreted component(s) of V.cholerae that induces an intestinal epithelial inflammatory response. Methods： Culture supernatants of wild type Vibrio cholerae O1 strain C6706 and its derivates were analyzed for capacity to induce changes in cytokine mRNA expression levels， IL8 and TNFα secretion， permeability and cell viability when added to the apical side of polarized tight monolayer T84 cells used as an in vitro model for human intestinal epithelium. Culture supernatants were also analyzed for PrtV and VCC content by immunoblot analyses and for hemolytic capacity. Results： Experiments with culture supernatants of different V.cholerae derivates suggested that VCC was capable of causing an inflammatory response characterized by increased permeability and production of IL8 and TNF α in tight monolayers. Capacity to induce this response in epithelial cells correlated to VCC content and hemolytic activity. Conclusion： The findings suggested that VCC induced the human intestinal epithelial inflammatory response. Furthermore， PrtV can mediate an environment dependent modulation of VCC induced inflammatory response.

　　［Key words］Vibrio cholerae protease; Vibrio cholera cytolysin; human intestinal epithelial cells; inflammatory response
　　
　　霍乱弧菌是霍乱的病原菌，人群通过摄入霍乱弧菌污染的水或食物引起腹泻性疾病。霍乱弧菌分泌的霍乱毒素(cholera toxin，CTX)是引起腹泻的主要因素。然而，大多数霍乱弧菌疫苗筛选菌株在临床实验中仍然表现出免疫反应性［1］，其作用的分子和细胞机理仍然不清楚。Levine等［2］发现一种先前未明确的肠道毒素在CTX缺失株可引起某些肠道症状，这些症状通常在CTX阳性菌株中被CTX引起的消化道症状掩盖。这些肠道毒素可能是霍乱弧菌分泌的血液凝结蛋白酶(hemagglutinationprotease， Hap protease)［3］、多功能的RTX毒素(repeats in toxin)［4］和霍乱弧菌溶细胞素(Vibrio cholera cytolysin，VCC)［5］。
　　
　　使用逆向分子遗传学方法，Vaitkevicius等［6，7］在霍乱弧菌O1株C6706发现霍乱弧菌蛋白酶(Vibrio cholerae protease， PrtV)与抗天然原生动物如鞭毛虫和纤毛虫的捕食有关。进一步研究发现，PrtV是霍乱弧菌定殖于美丽杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegans）肠道并最后促使线虫死亡的必需因素。由此假设霍乱弧菌疫苗试验中志愿者肠道炎症反应可能是由霍乱弧菌蛋白酶PrtV引起的。然而，用人Ｔ84肠道上皮细胞极化紧密单层细胞模型实验结果表明，PrtV不是肠道上皮细胞分泌白细胞介素8(interlukine8， IL8)的刺激因素，反而可降低由其他尚未明确的霍乱弧菌分泌因子引起的IL8表达［6］。为了进一步理解PrtV对于人和线虫肠道上皮细胞完全不同的作用，本文研究了霍乱弧菌分泌因子中引起人肠细胞炎性反应的成分及其相互关系。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 细菌菌株及培养
　　
　　使用的细菌菌株见表1，所有细菌培养在20 ml含30 μg/ml卡那霉素(kanamycin)LB培养基或含50 μg/ml氨苄西林(ampicillin)脑心浸液(BHI)培养基，37℃ 200 r/min振摇过夜，培养上清用无菌过滤器过滤。霍乱弧菌变异株构建按照文献［8］进行。表1 实验所用菌株，Tab 1 Bacterial strains（略）

　　1.2 肠上皮单层细胞培养
　　
　　参照文献［9］将人肠上皮T84细胞株培养在半透膜支持物上形成极化的人单层肠上皮细胞体外模型。当模型跨上皮细胞膜电阻(transepithelial electrical resistance， TER)≥1 000 Ohm/cm2 时，用不同霍乱弧菌菌株培养上清替换上室细胞培养基。单层肠上皮细胞在含5%CO2，37℃细胞培养箱中继续培养5 h，测定TER后，收集下室培养液用于细胞因子蛋白质含量分析。收集细胞，用PBS清洗2次后保存于1 ml 含4 mol/L 异硫氰酸胍、25 mmol/L枸橼酸钠、0.5% N月桂酰基肌氨酸、0.1 mol/L 2巯基乙醇(pH 7.0)溶液中，用于RNA提取。
　　
　　1.3 IL8和TNFα mRNA水平的测定
　　
　　总RNA提取参照文献［9］用酸性异硫氰酸胍酚三氯甲烷法。提取的RNA溶解于含1 000 U/ml核酸酶抑制剂RNasin(Promega公司)的无核酸酶水中并保存于-80℃。
　　
　　IL8和TNFα mRNA含量用即时定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)法。并采用TaqMan EZ技术，以18S rRNA为标准对照。测定结果表示为每18S rRNA单位mRNA拷贝数。
　　
　　1.4 IL8和TNFα分泌量测定
　　
　　使用人IL8和TNFα酶联免疫吸附测定试剂盒分别测定从单层细胞培养下室中收集的细胞培养液中IL8和TNFα的含量。
　　
　　1.5 溶血活性测定
　　
　　参照文献［10］方法测定血红蛋白释放量确定溶血活性。8%兔红细胞悬浮于含0.1%明胶的PBS。50 μl细胞悬液加到预先加入含50 μl不同菌株过夜培养上清系列稀释液的96微孔板中，微孔板在37℃温育120 min，然后1 800 g离心10 min，分别从每孔中转移50 μl上清到新的96微孔板中，用酶标仪在540 nm读取光密度值。
　　
　　1.6 蛋白印迹分析VCC和PrtV含量
　　
　　蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至二氟化树脂膜(PVDF)。用抗VCC和抗PrtV兔抗血清分别稀释1∶10 000 和1∶200 000鉴定蛋白质。抗兔免疫球蛋白偶联的辣根过氧化物酶(HRP)为二抗，最终稀释度为1∶20 000。电致发光和电化学发光系统用于检测化学发光水平，并用凝胶成像系统记录结果。
　　
　　1.7 统计分析
　　
　　每个实验重复3次，结果以均数±标准差表示，用GraphPad Prism 5.0数据分析和作图软件作图和分析数据。P≤0.05为差异有统计学意义。TER、细胞因子mRNA表达水平和IL8蛋白含量比较用t检验。溶血反应比较用单因素方差分析。
　　
　　2 结果

　　2.1 不同霍乱菌株LB培养上清对人肠道上皮细胞TER和IL8，TNFα表达的影响
　　
　　LB培养基中C6706wt培养上清刺激人肠上皮细胞体外模型肠腔侧后，TER保持高水平(图1a)；与之比较，ΔprtV培养上清引起TER明显降低，与LB空白对照组比较，下降至(12.5±1.1)%，提示ΔprtV培养上清引起人肠上皮细胞体外模型通透性增加。人肠上皮细胞体外模型LB空白对照与细胞培养液空白对照比较，IL8和TNFα mRNA表达水平分别为4.6±4.3和0.037±0.006 mRNA copies/18S rRNA 单位，差别无显著性。C6706wt培养上清刺激人肠上皮细胞体外模型肠腔侧后并未引起IL8和TNFα mRNA表达水平显著增加；而与LB空白对照和C6706wt组比较， ΔprtV培养上清引起IL8和TNFα mRNA表达水平增加(图1b，c)。与C6706wt比较，CTX缺失株或CTX/PrtV双基因缺失株并未引起人肠上皮细胞体外模型通透性和细胞因子表达有显著性差异(资料未显示)。

　　2.2 不同霍乱菌株BHI培养上清对人肠道上皮细胞TER和IL8，TNFα表达的影响
　　
　　用霍乱弧菌及其缺失株在BHI中的培养上清加入到人肠上皮细胞体外模型肠腔侧37℃培养5 h后，实验结果则完全不同(图2)。与BHI空白对照比较，PrtV缺失株和C6706wt在BHI培养上清都引起TER(图2a)明显下降，IL8和TNFα mRNA表达水平增加(图2b，c)。ELISA测定结果表明人肠道上皮细胞体外模型基底面IL8蛋白质水平明显伴随着IL8 mRNA水平升高(图2d)。同样方法未检测到TNFα蛋白(资料未显示)。反应程度与ΔprtV在LB培养上清刺激人肠道上皮细胞体外模型结果相似。

　　用VCC缺失株(Δvcc)和PrtV/VCC双基因缺失株(ΔprtV/Δvcc)在BHI培养基中培养上清刺激人肠道上皮细胞体外模型，结果显示维持相同的高TER，而单独的PrtV缺失株培养上清却引起TER明显降低(图2a)。IL8 mRNA和蛋白以及TNFα mRNA表达水平与BHI培养液空白对照一致(图2b～d)。这些结果表明VCC而非PrtV是引起人肠上皮细胞体外模型细胞炎性反应的因素。
　　
　　霍乱弧菌蛋白酶调节基因hapR阅读框架缺失株(ΔhapR)培养上清对TER和IL8的影响与PrtV缺失株有类似的变化(图2)，表明HapR缺失使PrtV和其他几种不同的蛋白酶失去表达，PrtV是引起VCC失去活性的主要成分。总而言之，这些结果表明在霍乱弧菌分泌的蛋白质中，VCC是引起人肠道上皮细胞炎性反应的主要因子，而PrtV可能是影响该炎性反应因子稳定性的因素，VCC在野生型霍乱弧菌分泌物中的活性丧失发生在细菌生长在LB培养基而非BHI培养基中。
　　
　　2.3 不同霍乱菌株两种培养上清的溶血活性
　　
　　用霍乱弧菌野生型C6706，PrtV缺失株和HapR调节子缺失株在LB培养基中过夜培养，分别测定不同培养上清对兔红细胞的溶血活性。PrtV缺失株和HapR调节子缺失株培养上清引起兔红细胞的溶血活性增加(图3a)，表明蛋白水解作用修饰VCC溶血活性。
　　
　　比较不同菌株在LB和BHI培养基中培养上清溶血活性，结果显示相同菌株在BHI中的培养上清比在LB中培养上清溶血活性低(图3b)。C6706wt在BHI培养基中过夜培养上清有较高的溶血活性，而在LB培养基中培养上清未见明显的溶血活性。其结果与人肠道上皮细胞体外模型炎性反应实验结果一致。不同霍乱弧菌株在LB培养上清有明显不同的溶血活性，实验还观察到C6706wt在BHI培养基中霍乱弧菌蛋白酶总表达水平降低(资料未显示)。在BHI培养基中的成分似乎抑制霍乱弧菌O1 El Tor C6706分泌蛋白酶的表达，但BHI培养基如何影响霍乱弧菌蛋白酶的合成仍然有待于分析。

　　2.4 不同霍乱菌株两种培养上清中VCC和PrtV水平
　　
　　采用抗VCC抗血清免疫沉淀法，分析霍乱弧菌野生型C6706株和VCC缺失株分泌VCC水平；同时采用抗PrtV抗血清平行比较总PrtV蛋白量。在PrtV缺失株和HapR调节子缺失株，与霍乱弧菌野生型C6706株比较，VCC水平明显增加，无PrtV表达(图4)。去除霍乱弧菌编码LuxO调节子基因后引起HapR水平的明显增加，可导致几种蛋白水解酶过量产生，由此降解VCC。如图4所示，在luxO缺失株包括两种培养基中过夜培养上清中VCC水平明显下降，PrtV明显增加。
　　
　　3 讨论
　　
　　VCC是一种由霍乱弧菌El Tor和非O1/O139菌株产生的成孔外毒素，在真核细胞膜上可以集合形成跨膜5聚体［11］。本研究结果显示，VCC是霍乱弧菌引起红细胞裂解和导致人肠上皮细胞炎性反应的主要因素。由此可见，VCC可以引起严重的肠道上皮细胞和血液中细胞的严重损伤。虽然并不清楚肠道上皮细胞炎性反应对整体胃肠道症状的贡献的程度，很显然，VCC引起肠道上皮细胞的炎性反应，包括增加上皮通透性和IL8、TNFα表达，表明肠道上皮细胞通过VCC引起IL8的释放导致局部的免疫防御作用。已经有作者提出VCC在胃肠炎的致病作用，尤其是不产生CTX的霍乱弧菌菌株［12］。重要的是，人肠道上皮细胞体外模型中肠道上皮细胞是极性的，体内情况下，细菌产物的受体如Toll样受体(Tolllike receptors， TLR)主要位于基底侧，人肠道上皮细胞体外模型的情况与此相类似。因此，一旦细菌及其释放的产物穿过肠道上皮屏障进入到机体，其他机制可能会起作用。
　　
　　实验结果显示，不管是在LB或BHI培养基，VCC引起的肠上皮细胞炎性反应作用被环境中PrtV所修饰。PrtV蛋白酶对于VCC引起肠上皮细胞以通透性增加和炎性细胞因子IL8、TNFα释放为特征的细菌分泌因子的稳定性有负面的影响。结果证实并明显地扩展了先前的研究结果，即PrtV缺失株在LB培养液中培养上清引起人肠上皮T84细胞体外模型IL8表达增加并与通透性增加有关［6］。
　　
　　本研究结果显示由VCC引起的肠道炎性反应几乎完全由于PrtV对VCC的降解而消除。PrtV对VCC的降解在更为复杂的培养环境条件下也仍然被一些未知因素所抑制。当野生型霍乱弧菌在BHI培养基培养时不发生蛋白质水解作用而当细菌在LB培养基培养时则降解，引起炎性反应的能力和裂解红细胞仅发现于当细菌生长在BHI培养基或PrtV基因缺失株。BHI似乎影响细菌的功能状态，所有霍乱弧菌蛋白酶的量在BHI培养基生长时降低。可能含有来自于二价离子培养基的螯合剂与PrtV分子中二价金属结合，由此使PrtV失活或富含PrtV底物竞争PrtV从而使VCC得以保留。肠腔内容物很可能更加与BHI相似而非LB，结果VCC的降解减少，VCC有机会对肠道上皮发挥其毒性作用继而导致细菌产物更容易进入体内各组织。
　　
　　综上所述，VCC是霍乱弧菌引起人肠上皮细胞炎性反应的主要因素，霍乱弧菌分泌的PrtV通过降解VCC而降低对肠上皮细胞的炎性反应。
　　　
　　（致谢：本研究在瑞典Umea大学医学院免疫学系完成。在瑞典期间，得到MarieLuise Hammarstrom教授和Sun Nyunt Wai副教授的资助和指导，特此感谢！）

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