IL28B mRNA在小鼠纤维化肺组织内的表达及意义

　　　　　　 作者：范利娟， 郑金旭， 徐丽娜

【摘要】 目的： 研究白介素28B(IL28B)mRNA在小鼠肺纤维化模型中的表达，探讨其在肺纤维化发病过程中的意义。方法： 健康昆明种雄性小鼠72只，随机分成3组：对照组(生理盐水)、模型组(博莱霉素)和治疗组(博莱霉素+泼尼松)，每组24只。第7，14，21，28天各组处死小鼠6只。无菌操作下取出小鼠肺组织，RTPCR检测IL28B的mRNA表达。结果： 第7，14，21天时，模型组IL28B的mRNA表达显著高于对照组(P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01);其中模型组14天时，IL28B表达最高。第7，14，21天时，治疗组IL28B的mRNA表达显著低于模型组(P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01)。结论： IL28B参与了肺纤维化的发生、发展过程，在肺纤维化的早期发挥了重要作用。

【关键词】 白介素28B; 干扰素λ3; 肺纤维化

　　[Abstract] Objective: To determine the expressions of Interleukin 28B(IL28B)in lung tissues of mice with pulmonary fibrosis(PF) induced by bleomycin at various periods and to study the effects of the cytokine in the pathogenesis of pulmonary fibrosis.Methods： Seventy two male mice were randomly pided into three groups: control group(n=24)， model group(n=24) and therapy group(n=24).The mice of control group were treated with normal saline by intratracheal instillation， while the mice of model group and therapy group treated with bleomycin solutions.From the first day after bleomycin challenge， the therapy group was perfused into stomach prednisone daily.On day 7， 14， 21， 28 after administration， 6 mice of each group were sacrificed and the lung tissues were harvested.The expressions of IL28B mRNA in lung tissue of mice were detected by method of RTPCR.Results： The expressions of IL28B mRNA detected in lung tissue of model group were higher than that of control group on the 7，14，21th day， and peaked on the 14th day.The expressions of the therapy group on the 7，14，21th day were lower than that of the model group.Conclusion： IL28B may contribute to the pathogenesis of pulmonary fibrosis in early period.

　　[Key words] interleukin 28B; interferon lambda 3; pulmonary fibrosis

　　肺间质纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种肺部异质性疾病，病理特点主要表现为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化。特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是其中病因不明、进展快、具有致死性的一类疾病。目前， IPF的发病率在全球呈上升趋势，其发病机制尚不明确，而细胞因子的网络调控在其中占了重要的作用。IL28B是2003年发现的新型细胞因子，又称干扰素λ3(interferon lambda 3， IFNλ3)[1]。目前国内外关于IL28B和肺纤维化关系的研究报道尚较少。本研究采用一次性气管内滴注博莱霉素(bleomycin， BLM)的方法建立小鼠肺纤维化模型，并用泼尼松灌胃进行治疗，检测小鼠肺组织内的IL28B mRNA表达水平， 以探讨IL28B与肺纤维化的关系。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　健康雄性昆明种小鼠由江苏大学医学院实验动物中心提供，鼠龄8周，体质量18～22 g。注射用盐酸博来霉素粉剂，日本化药株式会社产品。低糖DMEM，PBS购自Gibco公司， Trizol试剂盒购自Invitrogen公司， Taq酶购自Promega公司，PCR试剂购自Promega公司。

　　1.2 肺纤维化动物模型的建立

　　将实验动物随机分成对照组、模型组、治疗组3组，每组24只。用10%水合氯醛(3～4 ml/100 g)腹腔注射麻醉模型组和治疗组的小鼠，无菌条件下行颈正中切口，显露气管，按5 mg/kg体质量抽取BLM液约0.06～0.07 ml，穿刺并注入气管内，对照组用同样方法气管内注入生理盐水(0.06～0.07 ml)。上述3组动物分别于第7，14，21，28天各处死6 只， 无菌条件下取出肺组织迅速放入-70℃中保存， RTPCR法检测IL28B的mRNA表达。

　　1.3 IL28B mRNA的检测

　　取小鼠新鲜肺组织40～50 mg，加入1 ml Trizol，匀浆破碎组织，置室温10 min后加入200 μl氯仿剧烈震荡15 s，12 000 r/min，4℃低温离心15 min。取上清加入600 μl异丙醇，室温静止10 min。12 000 r/min，4℃低温离心10 min，弃上清液。加入1 ml 75%乙醇。7 500 r/min，4℃低温离心10 min，弃上清液。室温干燥RNA 5 min后，加入20 μl DEPC处理过的水进行溶解，样品置于-70℃保存。逆转录反应按试剂盒说明进行操作。PCR循环参数为: 94℃预变性3 min，使用3步法，具体为:94℃ 45 s， IL28B 56℃/GAPDH 55℃ 50 s， 72℃ 60 s，35个循环扩增。取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。以cDNA为模板，PCR扩增出IL28B及GAPDH基因片段，将产物回收、纯化;然后测定其DNA浓度，十倍梯度稀释，制作标准曲线。目的基因的引物序列和片段长度如下: ①IL28B 基因引物: 正义链为5′GTGCAGTTCCCACCTCATCT3′(212 bp)，反义链为5′CTGTGGCCTGAAGCTGTGTA3′; ②GAPDH 基因引物:正义链为5′GCTGGTCATCAACGGGAAA3′(105 bp)，反义链为5′ACGCCAGTAGACTCCACGACA3′。

　　1.4 统计学处理

　　所得数据以(±s)表示，采用SPSS16.0软件，多组均数间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　在对照组各时期内，IL28B mRNA在小鼠肺组织内有微弱信号，而模型组肺组织内的信号则比对照组强，以第7，14，21天为明显，第14天为高峰，见图1。第7，14，21天时，模型组与对照组同期比较差异有统计学意义(P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01);第7，14，21天时，治疗组与模型组同期比较差异有统计学意(P&<0.05，P&<0.01，P&<0.01)，见图2。

　　3 讨 论

　　特发性肺纤维化(IPF)的主要临床症状是劳力性气促和慢性干咳，确诊后中位生存时间仅为3～5年。IPF的发病机制还不完全清楚，但近年来的一些研究表明，肺泡上皮细胞在肺纤维化的发生、发展中扮演了一个重要的角色。肺泡上皮细胞损伤可导致成纤维细胞增殖，受损的肺泡上皮细胞本身也能向肌成纤维细胞表型转变，即上皮细胞间质转化(epithelialtomesenchymal transition，EMT)[2]。本课题组用重组人转化因子β1成功诱导了A549细胞发生上皮细胞间质转化[3]。

　　IL28B是和IL28A，IL29同时被发现的一类细胞因子，分别又称为IFNλ3，IFNλ2，IFNλ1[1，4]。因与Ⅰ型干扰素有相同的信号途径，故被命名为Ⅲ型干扰素， 其生物学功能与Ⅰ型干扰素相似：抗病毒、抗增殖以及免疫调节活性[5]。IFNλs的受体是由IFNLR1和IL10R2组成的异二聚体[6]。IFN λs的应答具有组织依赖性，与其受体(IFNLR1)的表达一致，应答显著的组织主要有胃、肠和肺组织。IFNλs在体内主要作用于上皮细胞，可能与上皮细胞的特殊保护有关[7]。体外实验表明[8-12]，IL28B可在脂多糖、病毒DNA和RNA刺激下由外周血单核细胞、淋巴细胞、上皮细胞、巨噬细胞、类浆树突细胞、单核来源的树突细胞等产生，其中肺组织是体内对IL28B应答的一个主要场所。

　　本实验发现3组小鼠肺组织内IL28B均有表达;在模型组的表达强度明显高于对照组，第14天为峰值;治疗组的表达低于模型组。3组中IL28B表达量的差别说明，IL28B参与了小鼠肺纤维化的病理发展过程，并可能发挥了重要作用。模型组的早期，IL28B表达增强，而此时肺纤维化处于炎症期;在模型组的晚期，即纤维化期，肺泡细胞大量凋亡，IL28B表达降低。因此，推断肺组织内的IL28B主要是由肺泡上皮细胞表达，其受激发的因素可能是博莱霉素。肺泡上皮细胞受损后，大量的趋化因子产生，导致巨噬细胞、中性粒细胞等炎性细胞增加，这类细胞也可能表达IL28B。对照组有IL28B表达，说明肺泡上皮细胞在正常情况下也能少量表达IL28B。当受博莱霉素刺激后，肺泡上皮细胞表达IL28B的量显著增加。因早期肺泡上皮细胞数量较多，所以IL28B的表达量也高，同时，被活化的炎症细胞(巨噬细胞、淋巴细胞等)也逐步增加IL28B表达，使肺组织中IL28B表达量进一步增加至峰值。当肺泡上皮细胞大量凋亡时，IL28B的表达随之减少。

　　IPF的发病机制十分复杂，涉及的细胞因子众多。IL28B在肺纤维化过程中表达量有变化，这为研究IL28B在肺纤维化中的作用打开了一个窗口，进一步研究IL28B的定位以及拮抗其受体等可以为阐明该细胞因子在肺纤维化中的作用提供更多依据。

参考文献

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