吡咯喹啉醌对γ射线照射后AGS细胞抗氧化力的影响

　　 作者：邱秀芹，刘春亮，徐岚，赵俊宇，吴士良

【摘要】 　　目的： 探讨吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)对60Coγ射线照射细胞清除自由基能力。方法： 培养AGS细胞至对数期，实验分为6组：正常培养未照射组、单纯照射组、PQQ培养12 h未照射组、PQQ培养4 h未照射组、PQQ培养12 h后照射组、PQQ培养4 h后照射组。60Coγ照射，剂量8Gy。照射后6，12，24 h测定细胞总抗氧化力（TAOC），SOD，MDA含量。结果： 与正常未照组比较，照射后6，12，24 h单纯照射组SOD，TAOC显著降低（P&<0.05），MDA显著升高（P&<0.01）；与单纯照射组比较：PQQ培养的照射组SOD，TAOC显著升高（P&<0.01），除照射后6 h外MDA显著降低（P&<0.05）。结论： PQQ可通过增强细胞抗氧化能力，降低氧化水平，从而对辐射细胞起保护作用。

【关键词】 AGS细胞； 吡咯喹啉醌； 抗氧化力

　　［Abstract］Objective: To investigate PQQ scavenging free radicals in cells by γray radiation.Methods： AGS cells were cultivated. There were 6 groups in our experiment: the normal group， simply irradiated group， nonirradiated group treated with PQQ by 12 hours， nonirradiated groups treated with PQQ by 4 hours， irradiated groups treated with PQQ by 12 hours， irradiated groups treated with PQQ by 4 hours. The radiation was 60Coγrays with the dose of 8Gy. After irradiated 6 h， 12 h， 24 h， the cells were measured of theses level: total antioxidation competence(TAOC)，SOD，MDA. Results： The level of TAOC and SOD decreased (P&<0.05)，and the level of MDA increased (P&<0.01)in simply irradiated groups after irradiated 6 h， 12 h， 24 h，in comparison with the normal group. The level of TAOC and SOD increased (P&<0.01) in irradiated groups treated with PQQ in comparison with the simply irradiated group; and the level of MDA decreased (P&<0.05). Conclusion： PQQ can protect radiated cells，by strengthening antioxidative competence and lessening the oxidation of cells.

　　［Key words］AGS cell; pyrroloquinoline quinone; antioxidation competence

　　从食品辐照、医用射线到空间电离辐射，辐射无处不在。大剂量辐射可引起机体多种组织和器官的损伤，甚至诱发细胞突变、癌变、致死等严重后果。如何增强机体抵抗力，防止或减轻辐射对人体健康的危害，研究高效、低毒的辐射防护剂显得非常重要。
　　
　　吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)是一种氧化还原酶辅基，作为电子的供体和受体参与氧化还原过程［1］。PQQ具有一些重要的生物活性和功能：如刺激微生物、人体细胞生长和植物发育等。本实验室已初步研究PQQ对高能电子射线照射引起的大鼠皮肤损伤有一定的防护作用，PQQ能有效提高自由基清除酶系活性，部分清除电子直线加速器照射后产生的自由基［2］。本实验以胃癌细胞AGS为研究对象，通过检测60Coγ射线照射后AGS细胞中抗氧化能力及自由基含量的变化，探讨PQQ对细胞的辐照损伤效应的影响。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 主要仪器和试剂
　　
　　胃癌细胞系AGS购自上海生科院，本室培养；PQQ由上海复旦大学生物化学教研室惠赠；丙二醛(MDA)、总抗氧化力(TAOC)和超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；60Co照射装置由苏州大学核辐照中心提供。
　　
　　1.2 细胞培养、实验分组与处理
　　
　　胃癌细胞AGS培养在含10％小牛血清的RPMI1640培养液中，置37℃ 50 ml/L CO2培养箱中，保持饱和湿度，环境温度为25℃。取对数生长期的细胞，经台盼蓝染色，活细胞超过80％者用于实验。实验分6组：正常未照射组（A组）、单纯照射组（B组）、PQQ培养12 h未照射组（C组）、PQQ培养4 h未照射组（D组）、PQQ培养12 h后照射组（E组）、PQQ培养4 h后照射组（F组）。PQQ溶解在无血清的RPMI1640培养基中，0.22 μm孔径滤过除菌，4℃避光放置备用。PQQ在培养液中的终浓度为10 μmol/L。取对数生长期细胞，接种于6孔培养板中，每孔达3×106，贴壁过夜。C，E组于照射前12 h换含PQQ的培养液，D，F组于照射前4 h换含PQQ的培养液，B，E，F组采用苏州大学核辐照中心60Co射线照射装置，剂量8 Gy，剂量率1 Gy/min进行单次照射。共做6批。
　　
　　1.3 细胞SOD，TAOC，MDA测定
　　
　　取对数生长期细胞，每孔3×106细胞数接种于6孔培养板，贴壁过夜。按分组要求加入PQQ。细胞照射后6，12，24 h，0.25%胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗2 次，弃洗液。取各组细胞加PBS 1 ml，Tris100裂解细胞，离心取上清液。用比色法按试剂盒说明测定SOD，TAOC，MDA含量。
　　
　　1.4 统计学处理
　　
　　实验结果用均数±标准差(±s)表示，数据处理用社会学统计程序包SPSS11.5软件系统，经方差分析后，两两比较采用t检验。

　　2 结 果

　　2.1 60Coγ射线照射后不同时间点各组细胞SOD，TAOC含量变化
　　
　　照射后6，12，24 h，B组细胞TAOC，SOD明显低于A组（P&<0.05）；C，D，E，F组细胞TAOC，SOD均显著高于A组（P&<0.05），C，D，E，F组均显著高于B组(P&<0.01)。照射前4 h和照射前12 h换PQQ培养液比较差异无统计学意义，PQQ培养的未照组与照射组细胞比较差异无统计学意义（表1，表2）。表1 PQQ对60Coγ射线照射AGS细胞TAOC 含量的影响，Tab 1 Effects of TAOC activity by PQQ 60Coγray irradiation on AGS cells（略）；表2 PQQ对60Coγ射线照射AGS细胞TSOD 含量的影响，Tab 2 Effects of TSOD activity by PQQ 60Coγray irradiation on AGS cells（略）
　　
　　照后6，12，24 h，B，E，F组细胞MDA明显高于A组（P&<0.01）；照射后12，24 h，E，F组细胞MDA明显低于B组（P&<0.05）；各时间点C，D组细胞MDA与A组比较差异无统计学意义(表3)。表3 PQQ对60Coγ射线照射AGS细胞MDA含量的影响，Tab 3 Effects of MDA concentration by PQQ 60Coγray irradiation on AGS cells（略）

　　3 讨论
　　
　　电离辐射对生物体可造成严重损害。电离辐射可直接作用于核酸、蛋白质及酶类，引起电离和化学键断裂，使分子变性和细胞结构破坏；也可以作用于机体内水分子，使其发生电离和激发，产生大量具有强氧化性能的自由基，间接使组织细胞变性、坏死，致使代谢紊乱，引起免疫、神经和内分泌系统功能障碍［3］。本研究显示8 Gy60Coγ射线照射AGS细胞后于6，12，24 h细胞SOD，TAOC均明显降低，MDA显著升高，细胞死亡增加，发生了明显的辐射损伤生物学效应。
　　
　　吡咯喹啉醌为B族维生素［4］，Urakami等［5］用电子自旋共振(ESR)光谱法分析证实PQQ具有很强的自由基清除能力，其清除自由基的能力比抗坏血酸高50～100倍。对心肌的缺血再灌注实验表明PQQ是有效的自由基清除剂，是一种高效的心肌保护剂［6］；Tao等［7］研究表明PQQ能减轻过氧化对心肌细胞的线粒体渗透，降低过氧化脂质的含量；Ohwada等［8］研究表明PQQ能提高神经系统由于氧化压力导致的认知能力下降，能抑制由于氧化造成的神经细胞的死亡［9］。
　　
　　有研究表明携带PQQ合成酶基因的大肠埃希菌具有抗辐射及抗氧化能力是通过PQQ直接清除活性氧自由基及调动其他自由基清除机制实现的［10］。本研究结果显示，照射前PQQ培养的AGS细胞TAOC，SOD含量于照射后6，12，24 h各时间点均明显高于单纯照射组，照射前PQQ培养的AGS细胞MDA含量于照射后12，24 h明显低于单纯照射组，表明PQQ可提高细胞的抗氧化能力，降低自由基水平，保护辐照细胞免受自由基攻击，从而对细胞辐照损伤有一定的防护作用。同时，研究结果显示，PQQ处理的未照射AGS细胞TAOC，SOD含量于各时间点均明显增加，而MDA含量没有显著差异。表明PQQ也能增强正常细胞的抗氧化酶的合成，其具体机制有待进一步研究。

参考文献

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　　［9］Nunome K，Miyazaki S，Nakano M，et al．Pyrroloquinoline quinone prevents oxidative stressinduced neuronal death probably through changes in oxidative status of DJ1［J］．Biol Pharm Bull，2008，31(7)：1321-1326．

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