EvaGreen 染料法实时定量PCR检测急性髓系白血病PRAME基因转录本

　　　　 作者：朱照辉 林江 钱军 姚冬明 钱震 王雅丽 韩兰秀 肖高飞

【摘要】 目的： 采用实时定量聚合酶链反应(RQPCR)法检测急性髓系白血病(AML)中黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)基因转录本，初步评价其在AML中的临床意义。 方法： 设计PRAME基因引物，建立扩增PRAME基因转录本的EvaGreen染料法RQPCR法，对PRAME转录本克隆质粒进行扩增，评价其特异性、重复性和灵敏性。并对10例AML患者的骨髓单个核细胞标本进行初步检测。 结果： 所建立的EvaGreen RQPCR法具有良好的特异性，最低可检测到10个拷贝/μl的阳性模板，但其重复性差，而108～102拷贝/μl阳模的重复性良好。10例初诊AML患者PRAME转录本绝对含量为4.91×102～8.07×105拷贝/50ng(中位7.26×103拷贝/50ng)，ABL标化后的相对含量为4.42%～13 170.01%(中位67.98%)。而对照组8例缺铁性贫血患者中PRAME转录本相对含量为 0.00%～0.01% (中位0)。1例AML患者诱导缓解后PRAME转录本下降，复发时又明显升高。结论： EvaGreen染料法RQPCR检测PRAME转录本方法敏感可靠，可用于AML患者临床监测。

【关键词】 实时定量PCR; EvaGreen染料; PRAME基因; 急性髓系白血病

　　[Abstract] Objective: To evaluate the method of realtime quantitative polymerase chain reaction(RQPCR) with EvaGreen dye for detecting the preferentially expressed antigen of melanoma(PRAME) transcripts in patients with acute myeloid leukemia(AML). To investigate preliminarily the characteristics and clinical implication of PRAME transcripts in AML.Methods： The primers of PRAME transcript were designed. The condition of RQPCR with EvaGreen was established to detect PRAME and ABL positive templates. To evaluate the utility of this assay， the samples of bone marrow mononuclear cells from 10 patients with AML were detected. Results： There was a good specificity in the EvaGreen RQPCR. In repeated tests， maximal sensitivities of 10 copies/μl were obtained， while reproducible maximal sensitivities achieved 100 copies/μl. The median absolute and normalized amount of PRAME transcripts were 7.26×103(4.91×102～8.07×105) copies/50ng and 67.98%(4.42%～13 170.01%) respectively. In one AML case， the PRAME transcript level significantly decreased after induction therapy compared to the moment of diagnosis， but significantly increased after relapse. In the control group， consisting of eight samples from patients with iron deficient anemia， the normalized PRAME transcript level was 0.00%～0.01%(median 0). Conclusion： EvaGreen RQPCR for PRAME transcript was a sensitive， reliable quantitative assay and can be used in the diagnosis of AML and the disease followup.

　　[Key words] realtime quantitative PCR; EvaGreen dye; PRAME gene; acute myeloid leukemia

　　黑色素瘤优先表达抗原(preferentially expressed antigen of melanoma，PRAME)最初是Iked等从黑色素瘤中分离出来的一种肿瘤相关抗原，能被细胞毒性T细胞(cytotoxic T lyphocyte， CTL)识别[1]。PRAME基因位于染色体22q11，编码509个氨基酸的蛋白质，在除睾丸以外的正常组织中不表达或低水平表达[2]，在包括白血病在内的多种肿瘤细胞中高度表达，其表达水平随病情变化趋势与白血病的特异性分子标志相一致，可考虑将PRAME基因作为一种白血病病情动态监测的分子标志，用于评价微小残留病(minimal residual disease，MRD)[3，4]。我们建立了荧光染料EvaGreen RQPCR法检测PRAME基因转录本并对其进行评价，证实EvaGreen RQPCR具有良好的特异性、重复性、敏感性，可用于批量标本的检测。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例资料

　　10例初诊AML均为本院血液科住院患者，诊断按《血液病诊断及疗效标准》[5]，其中M1 2例、M2 3例、M3 1例、M4 2例、M5 2例;对照组为8例缺铁性贫血(IDA)患者。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 细胞分离和RNA提取 全部患者均于初诊时抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞(MNC)，应用Trizol一步法提取总RNA，经紫外分光光度仪定量，保存在-80℃备用。

　　1.2.2 逆转录 将2.0 μg总RNA应用六随机引物逆转录合成第一链cDNA，总体系40 μl，含MMLV逆转录酶200 U﹑dNTP(每种0.5 mmol/L)，10 mmol/L DTT，RNAsin 25 μl，37℃逆转录1 h，95℃ 5min灭活，cDNA保存于-20℃备用。

　　1.2.3 定性PCR扩增 扩增根据文献[6]合成PRAME基因引物，序列分别为5′TTTCCCCGGAGAAGGAG3′(上游引物)，5′CGAAAGCCGGCAGTTAGTT A 3′(下游引物)，扩增片段为179 bp;应用看家基因ABL作为内参照，其上游引物为5′TCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGA3′，下游引物为5′TCCAACGAGCGGCTTCAC3′，引物于上海基康生物技术公司合成。25 μl反应体系含cDNA 100 ng，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl，Taq酶0.5 U，10×缓冲液2.5 μl，10 pmol引物1.0 μl。反应条件为95℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环，最后72℃ 7 min。PCR产物经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

　　1.2.4 阳性模板制备 将1例AML患者的PRAME定性PCR扩增产物克隆入PGEMT载体，扩增纯化重组载体、测序鉴定(上海基康)，并将其定量。最后从108拷贝/μl开始进行10倍稀释，建立阳性模板梯度，4℃储存备用。

　　1.2.5 EvaGreen RQPCR 引物序列同定性PCR。25 μl反应体系包含cDNA 50 ng，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μl，MgCl2 4.0 μl，10 pmol/μl引物0.5 μl，20×EvaGreen(BIOTIUM公司)1.2 μl，50× ROX 0.5 μl，Taq酶1.0 U(MBI公司)。扩增在PE7300(美国ABI公司)扩增仪上进行。反应条件为94℃ 4min，然后94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，82℃ 30 s，共50个循环，于82℃收集荧光。熔解曲线程序为95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s。PRAME转录本的绝对量表示为每50 ng总RNA中含有的拷贝数，而每个患者中PRAME表达的值则以相对定量表示(NPRAME=PRAME转录本拷贝数/ABL转录本拷贝数×100%)。

　　1.3 统计学处理

　　应用SPSS13.0软件包计算中位数、变异系数;AML与IDA患者PRAME基因转录本差异应用MannWhitney U检验，设定P值为双侧分布，以P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 EvaGreen RQPCR灵敏度、重复性、特异性和扩增效率

　　PRAME质粒经测序结果与基因库序列符合(NM_006115)。对不同浓度PRAME质粒和ABL质粒分别扩增6次，最大灵敏度都能达到10拷贝/μl，但其重复性不好，6次扩增PRAME质粒2次为阴性，ABL质粒3次为阴性;而108～102拷贝/μl的重复性良好(表1)。模板与CT值的相关性分别为0.990 6和0.999 1，标准曲线的斜率(slope)分别为3.367 6和3.378 31，PCR扩增效率(=10-1/slope)分别为1.981 287和1.976 997。6次无模板对照(NTC)均无扩增信号。图1为PRAME基因的荧光扩增曲线和标准曲线。表1 不同浓度PRAME和ABL基因扩增6次的变异系数

　　2.2 EvaGreen RQPCR检测AML患者PRAME基因表达

　　如待测标本的CT值比最大稀释度阳模的CT值加4个循环数小，则将PRAME判定为阳性，反之，如待查标本的CT值比最大稀释度阳模的CT值加4个循环数大，则判定为阴性，如无EvaGreen RQPCR扩增也认为结果为阴性[7]。10例初诊AML患者中PRAME转录本的检测结果均为阳性，其CT值介于20.53～31.31之间，绝对数量为4.91×102～8.07×105(中位7.26×103)拷贝/50ng，NPRAME为 4.42%～13 170.01%(中位67.98%)。而8例对照中PRAME转录本量为0～247.56(中位14.42)拷贝/50 ng，NPRAME为0.00%～0.01%(中位0.00%)。AML患者与IDA患者之间PRAME转录本水平的差异具有统计学意义(P=0.01)。

　　2.3 1例AML患者的动态监测结果

　　对1例患者的冻存随访标本进行检测，其在病程中PRAME拷贝数变化见图2。初发时达到809.28%，经治疗达到第1次完全缓解(CR)后降至 1.35%，5.5月后复发时再次增高达328.93%，再次诱导化疗达CR2后又降至1.36%。

　　3 讨 论

　　大量研究已经表明MRD监测对于白血病患者预后判断和分层治疗具有重要的指导意义，应用RQPCR监测白血病特异性融合基因是目前监测白血病MRD的主要手段之一。但AML患者中特异性融合基因发生率仅为30%～50%，其中较为常见的AML1/ETO，PML/RARα，CBFβ/MYH11等则仅为20%左右[8]。寻找更多的白血病相关的分子改变一直是白血病MRD监测研究中的一个重要内容，近年来发现WT1，BCL2，PRAME等可能是潜在的白血病相关分子[9]。Tajeddine等[3]证实PRAME基因转录本水平随着病情变化而改变，与AML1/ETO融合基因转录本一样，可有效用于检测AML患者的MRD;Qin等[4]的研究表明监测PRAME转录本水平改变可预测AML疾病复发。

　　目前主要是通过SYBR Green I染料法和探针法RQPCR检测PRAME转录本表达水平[2，4]。EvaGreen是近年来研发的一种新型双链DNA结合荧光染料，稳定性强，刚刚开始被应用于DNA定量和构象分析、高分辨率熔解曲线(HRM)分析，由于其对PCR的抑制性要远小于SYBR Green I，在PCR时可以应用较高浓度，进而可以获得更强的荧光信号，较SYBR Green I更为适用于RQPCR检测[10]。我们的研究结果表明EvaGreen RQPCR检测PRAME转录本具有良好的重复性和灵敏性，并且PCR过程中在二聚体与目的基因的Tm值之间设置温度收集荧光信号，去除了引物二聚体的干扰，可得到特异性目的基因的扩增信号，进一步提高了荧光染料法RQPCR的特异性。对10例AML患者的检测结果也初步证实了本法的可靠性，对1例AML患者随访标本的监测也初步表明EvaGreen RQPCR可有效用于MRD监测。本研究揭示EvaGreen RQPCR是一个简便、可靠、精确、快速的高通量定量检测技术，可用于大样本的临床研究。

参考文献

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