幽门螺杆菌 γ谷氨酰转肽酶基因的克隆及序列分析

　　　　作者：唐炜， 张尤历， 王文兵， 陈慧娟

【摘要】 目的： 克隆不同疾病来源的幽门螺杆菌(Helicobacter pylori， Hp)γ谷氨酰转肽酶（Gammaglutamyltranspeptidase，GGT）基因，并进行序列分析。方法： 从人胃黏膜组织中分离培养获得Hp，提取其基因组DNA，对GGT基因进行 PCR扩增，克隆进 pMD18T 载体，进行测序和生物信息学分析，并与基因库中公布的标准株26695和J99的GGT氨基酸序列进行比对分析。结果： 成功克隆了分别来源于慢性胃炎，胃溃疡，十二指肠溃疡和胃癌的4种Hp菌株GGT片段，并进行了序列分析。4种病源的Hp GGT序列大小均为1 704 bp，编码 567 个氨基酸，理论分子质量是61 kDa，等电点是9.3，在N端具有信号肽，含有ATP蛋白激酶结合结构域和γ谷氨酰转肽酶保守结构域。序列比对分析显示，不同来源的Hp菌株GGT具有很高的保守性。结论： GGT在Hp中高度保守，具有分泌作用，可能对宿主细胞产生影响。该基因的成功克隆为进一步研究其功能打下了基础。

【关键词】 幽门螺杆菌； γ谷氨酰转肽酶； 基因克隆； 序列分析； 信号肽

　　［Abstract］ Objective: To clone and analyze the γglutamyltranspeptidase(GGT) gene of Helicobacter pylori(H.pylori).Methods： The strains of H.pylori were isolated from human gastric mucosa with the diseases of chronic gastritis， gastric ulcer， duodenal ulcer and gastric cancer;and cultured on solid agar medium.The GGT amplified by PCR from H.pylori DNA was cloned into T vector.The gene was sequenced and analyzed by the bioinformatics method.The sequences were compared with the typic H.pylori strains 26695 and J99. Results： The GGT gene was successfully cloned into pMD18T vector.The GGT contains 1 704 bp and encodes 567 amino acids with a predicted of 61 kDa， PI was 9.3.The gene had a signal peptide in the Nterminal and there were both protein kinases ATPbinding region signature and the γglutamyltranspeptidase signature.The sequence analysis showed that the amino acid sequences were highly conserved in different H.pylori strains. Conclusion： GGT of H.pylori is a conserved amino acid and has an important role in host cells.Cloning this gene will be helpful in its functional study.

　　［Key words］ Helicobacter pylori; γglutamyltranspeptidase; gene cloning； sequence analysis; signal peptide

　　自从1983年Warren和Mashall由人胃黏膜分离出幽门螺杆菌（Helicobacter pylori， Hp）后，Hp感染与慢性胃炎（chronic gastritis， CG）、胃溃疡（gastric ulcer， GU）、十二指肠溃疡（duodenal ulcer， DU）和胃癌（gastric cancer， GC）等疾病的关系逐步被人们所认识［1］。国际癌症机构已将Hp列为Ⅰ级致癌因子［2］。γ谷氨酰转肽酶(Gammaglutamyltranspeptidase，GGT)是一种催化肽基转移作用的酶，广泛存在于原核和真核细胞中［3］，在动物体内主要存在于肾、肝、胰等脏器，在谷胱苷肽的新陈代谢中起到了重要的作用［4］。Hp分泌的GGT通过抑制CD4+T细胞的增殖，从而抑制了CD4+T细胞对Hp的清除作用，可见GGT对Hp的定植有一定的作用［5］。GGT参与诱导Hp介导的程序性细胞死亡，可能是一个较好的抗肿瘤因子［6］。但程序性细胞死亡的持续发生，破坏了新细胞生成和细胞消亡之间的平衡从而产生病理作用［7］，凋亡调节基因的转变和突变的频繁发生，反而增加了胃癌发生的危险性［8］。有关GGT的生物学机制和在体内的效应还需要进一步的研究。本实验采用PCR技术分别扩增出了来源于胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡和胃癌的4种H.pylori菌株的GGT片段，并进行克隆和序列测定、序列分析，以了解GGT基因在致病过程中的变化情况，为进一步研究GGT的生物机制提供了依据。

1 材料与方法

　　1.1 材 料　

　　临床Hp菌株由本院内镜室活检标本分离培养获得。Hp基础培养基、微需氧环境发生袋、选择性抗生素及厌氧培养罐购自德国Merck公司。改良布氏肉汤培养基由上海腹泻疾病控制中心提供。无菌羊全血购自金坛欣迪公司。大肠埃希菌E.coli DH5α为江苏大学生命科学研究院实验室保存。pMD18T载体、LATaq酶、质粒抽提试剂盒为TaKaRa公司产品。酵母提取物、蛋白胨为OXOID公司产品。其他常规试剂为市售分析纯。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 Hp的培养 活检组织标本经快速尿素酶试验证实Hp阳性，结合胃镜和病理结果分析诊断为慢性胃炎（5例），胃溃疡（5例），十二指肠溃疡（5例）和胃癌（5例）。将来源于这4种疾病类型的活检新鲜组织用接种环均匀涂于固体琼脂培养基，在微需氧环境下，37 ℃培养约3～5天后收集细菌。

　　1.2.2 Hp基因组DNA提取 刮取培养96 h的菌落，按以下步骤提取DNA：用500 μl PBS液重悬细菌，4 ℃，12 000 r/min离心10 min；弃上清，100 μl TE液重新悬浮细菌，加入500 μl GES液混匀，冰上静置5 min；加入250 μl冰醋酸，冰上静置5 min；加入 650 μl氯仿混匀，4℃，12 000 r/min离心10 min；取上清，重复上述步骤；加入 350 μl的异丙醇，混匀，室温静置5 min； 4 ℃，6 000 r/min离心1 min；弃上清，用 500 μl 70% 乙醇洗涤， 4 ℃，6 000 r/min离心 1 min；弃上清，重复上述步骤；开盖自然晾干后加入适量 TE 液，4 ℃过夜溶解。于-20 ℃保存备用。

　　1.2.3 引物合成 根据基因库中已报道的Hp 26695标准株的GGT全序列，设计PCR 引物。上游引物 P1：5′GGCAAGCTTATGAGACGGAGTTTTTTGAAA 3′；下游引物 P2：5′GCAGGTACCTTCTTTCCTTGGATCTGG ATC CG 3′。在上游引物5′端加Hind Ⅲ酶切位点；在下游引物5′端加Kpn I 酶切位点。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

　　1.2.4 PCR 扩增 GGT 片段 以获得的Hp基因组DNA为模板，P1和P2为引物，用LATaq聚合酶进行PCR扩增。在 20 μl 反应体系中，分别加入dNTP 3.2 μl，10×PCR缓冲液2.0 μl，DNA模板1 μl，P1和P2引物各0.3 μl，Taq聚合酶0.2 μl，ddh3O 13.0 μl，94 ℃ 5 min，94℃60 s，59℃60 s，72℃3 min，35个循环，72℃延伸10 min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Genius凝胶电泳图像分析系统分析鉴定。

　　1.2.5 TA克隆 胶回收试剂盒回收GGT片段，胶回收产物与pMD18T载体在16℃连接过夜。连接产物转化DH5α感受态细菌。转化后的细菌涂布于含100 μg/ml氨苄西林的LB平板上，37℃培养10～12 h。挑取菌落接种于含氨苄西林100 μg/ml的LB液体培养基，37℃150～200 r/min振荡培养12～14 h。用碱裂解法进行质粒小量提取。

　　1.2.6 重组质粒的酶切鉴定及测序 获得重组质粒pMD18TGGT后用BamH I和Pst I双酶切，酶切产物经1.0%的凝胶电泳鉴定。采用M13通用引物，正反向各一个循环测定重组质粒DNA序列（由上海英骏生物技术有限公司完成）。

　　1.2.7 GGT 序列比对 用MEGA 4.0生物软件对菌株测序结果和基因库中的Hp标准株 26695和J99的GGT氨基酸序列进行比对分析。

2 结 果

　　2.1 GGT的扩增

　　PCR 扩增所得的4种不同疾病来源菌株的GGT片段均为1 704 bp，与预期大小相符，如图1所示。

　　2.2 pMD18TGGT 的克隆及筛选　

　　将4个不同疾病来源的菌株的GGT克隆于pMD18T载体后用BamH I和Pst I双酶切鉴定，所获片段大小与预期相符，如图2所示。

　　2.3 序列分析　

　　Hp GGT序列大小均为1 704 bp，编码567个氨基酸，理论分子质量是61 kD，等电点是9.3，在N端具有信号肽，剪切位点位于第26和27氨基酸处，含有ATP蛋白激酶结合结构域和 γ谷氨酰转肽酶保守结构域，如图3所示。采用MEGA 4.0生物软件对4种不同疾病来源的20例菌株氨基酸序列与基因库中的Hp标准株26695和J99相应氨基酸序列进行比对。结果显示，与Hp标准株26695和J99株比较，氨基酸同源性均高达98%以上。这些突变均发生在非功能结构区域，不同疾病来源的Hp菌株中的GGT结构区和功能区均没有变化，该基因所编码的蛋白质具有很高的保守性。

3 讨 论

　　GGT是谷氨酰循环中的关键酶，可特异性催化γ谷氨酰基的转移反应。Hp GGT被发现也具有相似的特点。目前大量的哺乳动物细胞的 GGT已经被纯化，它们的性质和功能也已被确定。很多细菌的GGT也已经被鉴定和调查，但是Hp GGT的成熟过程仍然不十分清楚。

　　目前，已经对Hp的凋亡诱导因素做了一些研究［9-11］。有研究报道 GGT 具有诱导细胞凋亡的活性，目前被广泛接受的观点是线粒体在凋亡的调节中起到了关键的作用［12］，GGT通过诱导线粒体介导的程序性细胞死亡，主要是细胞色素C由线粒体释放进入细胞质和半胱天冬酶（caspase）家族成员的激活［13］，诱导的细胞凋亡在胃癌致病过程中可能起到了重要作用［14］。相反，GGT缺陷的突变体不能诱导细胞凋亡。这些结果显示Hp GGT基因参与了程序性细胞死亡。

　　字母标注底色是深灰色者，为 γ谷氨酰转肽酶保守结构域；字母标注底色是浅灰色者，为该菌株ATP蛋白激酶结合结构域；14分别为来源于慢性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡以及胃癌的菌株。

　　本研究从不同疾病来源的Hp菌株中成功克隆了Hp GGT基因，对其所编码的氨基酸序列进行比对分析表明，不同疾病来源的20例Hp菌株中，氨基酸同源性均高达98%以上，GGT基因序列结构域与功能域均没有变化而呈高度保守。

　　Hp GGT基因在N端具有信号肽，在分泌和成熟后通过离子键与细胞膜结合，可能对宿主细胞产生影响［15］。但是Hp GGT的成熟过程以及其诱导的程序性细胞死亡的信号通路仍然不十分清楚。本研究成功克隆GGT基因，为进一步研究GGT基因的生物学功能及潜在的临床应用前景等奠定了实验基础。

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