关于基因重排检测技术诊断脾脏淋巴瘤

　　　　　　　　 作者：朱少君　李艳红　张伟　王姝妹　巩丽　兰淼　　

【摘要】 目的: 利用B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨1例原发性脾脏恶性淋巴瘤(PLS)基因重排检测结果. 方法: 从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果. 结果: 脾脏淋巴瘤免疫组化证实为B细胞性滤泡性淋巴瘤. 从24个不同部位取得的组织经PCR均扩增成功，所有部位组织T细胞受体基因重排阴性，22个部位组织B细胞单克隆性免疫球蛋白基因重排阳性，基因重排阳性率91.7%. 结论: 应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，对脾脏淋巴瘤有较高的诊断价值.
　　
【关键词】 淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；脾脏
　　【Abstract】 AIM: To assess the significance of detecting the gene rearrangements of IgH and TCR in the diagnosis of primary malignant lymphoma of the spleens (PLS). METHODS: Twentyfour samples were taken from different places of the PLS. Genomic DNA was extracted， and amplified via PCR. The products were resolved on denaturing polyacrylamide gels and visualized through silver staining. RESULTS: All samples were successfully amplified. Gene rearrangements of IgH and TCR were negative in 10 cases of reactive lymphoid hyperplasia. In all of the 24 samples from PLS， gene rearrangements of TCR γ and TCR β were not found， and IgH gene rearrangements were found in 22 samples (91.7%). There was remarkable difference between PLS group and benign group in gene rearrangment (P&<0.05). CONCLUSION: Detection of the gene rearrangements of IgH and TCR by PCR could be a kind of subsidiary means to diagnose the lymphoproliferative disease. It is very helpful in the diagnosis of splenic lymphoma.
　　【Keywords】 lymphoma; gene rearrangement; polymerase chain reaction; spleen

　　0引言
　　恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是脾脏最常见的恶性肿瘤，通常为全身性疾病的一部分. 原发性脾脏淋巴瘤(primary lymphoma of the spleen， PLS)少见，占所有淋巴瘤的1%~3%. 通过基因重排，机体产生大量多样的重排构型，编码种类繁多的抗原特异性抗体. 但对于一个个体及其后代，只含有其独特的重排构型，也就是说，一个T， B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化， 即可呈现特异的基因重排［1］. 因此， 对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断. 我们应用这一手段，探讨1例脾脏淋巴瘤的基因重排检测结果，并对该技术在脾脏淋巴组织增生性病变中的诊断价值进行探讨.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　脾脏恶性淋巴瘤标本1 例来自第四军医大学第二附属医院病理科. 女，69岁. 已排除淋巴瘤或白血病累及脾脏. 标本为40 g/L中性甲醛液固定，石蜡包埋. 制备厚度为4 μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、酒精冲洗，切片自然干燥. 用无菌双面刀片将组织刮入1.5 mL的离心管中，按以前的方法［2-3］提取基因组DNA. 引物序列由上海生工生物工程技术公司合成. 引物序列为: β球蛋白基因内对照 PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC， PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC; 免疫球蛋白基因重排(IgH) FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT，　　 LJH： TGAGGAGACGGTGACC，　　 VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG; T细胞受体基因重排(TCR β链和γ链) Db1: CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC， Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，　　 TVG: AGGGTTGTGTTGGAATCAGG，　　 TJX: CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC， Vγ11: TCTGGAGTCTATTACTGTGC，　　Vγ101: CTCACACTCTCACTTC，　　Jγ12: CAAGTGTTGTTCCACTGCC，　　 Jp12: GTTACTATGAGCTAGTCC.
　　1.2方法
　　PCR扩增在PT200型热循环仪（MJ Research）上进行. 反应体系为25 μL，含10 mmol/L dNTP（Gibco BRL） 2 μL，10×缓冲液2.5 μL，50 mmol/L MgCl2 0.75 μL，Taq DNA聚合酶（Gibco BRL） 16.67 nkat，20 pmol/L引物1 μL，DNA样品1~5 μL. IgH基因采用半巢氏PCR扩增: 第1轮引物为FR3A和LJH， 95℃预变性3 min， 然后94℃变性40 s， 62℃退火50 s， 72℃延伸40 s， 共30个循环; 最后72℃延伸10 min. 扩增产物经1∶100稀释后取1 μL进行第2轮扩增， 引物为FR3A和VLJH， 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s， 72℃延伸40 s， 共30个循环; 最后72℃延伸10 min. FR 3A与VLJH 扩增产物为100~120 bp. TCRβ和TCRγ采用40个循，其中TCRγ引物为Vγ11， Vγ101和Jγ12或Vγ11， Vγ101和Jp12的混合物. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，56℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. TCRβ扩增产物为65~ 85 bp. TCRγ各组扩增产物在70~200 bp不等. β球蛋白基因引物作为内对照进行扩增，共40个循环. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. 产物长度为110 bp. 琼脂糖凝胶（20 g/L）电泳评价扩增效果后，将3 μL产物和等体积的上样缓冲液［3］（990 mL/L甲酰胺，1 g/L溴酚蓝，1 g/L二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8 mm的聚丙烯酰胺凝胶（100 g/L，含尿素8 mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmacia Biotech）泳动8 h（80 V）. 取出后按以前的方法［3］银染，分别用UVP凝胶分析系统（UVP， Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果. 阳性结果判定标准：① PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1 mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符，与期望值相差不超过5 bp；③若出现期望值大小之外的其它条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.
　　
　　统计学处理：采用SPSS 10.0 统计分析系统对分类资料的差异或相关分析， 采用χ2检验， 以P&<0.05为有统计学意义.
　　2结果
　　2.1脾脏病理脾脏明显肿大， 脾脏表面凸凹不平，体积21 cm×14 cm×8 cm，质量790 g，切面灰白、灰黄色，呈粟粒状小结节弥散分布，结节直径0.2～0.5 cm，质地中等、均匀. 大体上表现为粟粒状小结节，主要累及白髓，低倍镜下肿瘤性滤泡遍布脾脏内，并且呈“背靠背”的密集排列，肿瘤性滤泡一般为圆形，大小不一，可以形状不规则. 一般较反应性生发中心小. 中心细胞具有稀少的细胞浆和不规则的、拉长的、有裂的细胞核. 细胞核较正常淋巴细胞稍大，染色质致密，但不如小淋巴细胞，核仁不明显. 中心母细胞和间变性中心细胞较正常淋巴细胞2-3倍或更大，核圆形或分叶状.
　　2.2免疫表型本例原发性脾脏恶性淋巴瘤起源于B 细胞. 其免疫表型：LCA()，CD20()，CD79α()，CD21()，Bcl2()，CK18（-），EMA（-），VIM（-），CD38（-），CD43（-），CD3（-），CD45RO（-），CD5（-），CD10（-），cyclinD1（-），CD30（-），CD15（-），κ链（-），λ链（-），Ki67（-），p53（-）.
　　2.3基因重排检测PC03，PC04引物对良性增生的淋巴组织以及阳性对照B，T淋巴瘤组织和本实验中的2个部位淋巴瘤组织DNA进行扩增，均见110 bp大小的β球蛋白特异条带（图1）. 10例良性淋巴组织反应性增生病例经FR3A/LJH， FR3A/VLJH引物采用半巢氏PCR扩增和一组TCRβ通用引物Db1/Jb2，3组TCRγ通用引物TVG/TJX，Vγ11/Vγ101/Jγ12和Vγ11/Vγ101/Jp12扩增均未见扩增产物或模糊条带（图2）. B细胞淋巴瘤阳性对照标本组织经FR3A /LJH，FR3A/VLJH引物采用半巢氏PCR扩增后出现110 bp大小IgH阳性条带（图3）. T细胞淋巴瘤阳性对照标本组织经一组TCRβ通用引物Db1/Jb2，3组TCRγ通用引物TVG/TJX，Vγ11/Vγ101/Jγ12和Vγ11/Vγ101/Jp12扩增，其中TVG/TJX引物扩增后出现190 bp大小TCRγ1阳性条带Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增后出现80 bp大小TCRγ2阳性条带（图4）. 从脾脏淋巴瘤不同部位取得的肿瘤标本24个经基因重排检测TCRγ和TCRβ基因重排均为阴性，22个部位IgH 基因重排均为阳性， 基因重排阳性率91.7%，与良性组相比，差异有显著意义(χ2=22.10， P&<0.05).

　　3讨论
　　脾脏恶性淋巴瘤由于结构特殊和类型复杂，其诊断一直是病理诊断中的难点，部分脾脏淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，给临床病理诊断带来了一定的困难. 干细胞在向淋巴细胞分化过程中， Ig重链基因(IgH)和T细胞受体(TCR)基因的可变区(V)和结合区(J)基因会发生重排， 即由分割的、无转录活性的基因片断在特异性重组酶的作用下联接成一个完整的、有转录功能的活性基因. 一旦完成基因重排， IgH和TCR基因即开始转录和表达， T，B细胞继续分化成熟. 反之，就发生凋亡而被清除. 在正常情况下，B细胞分化的最早阶段IgH重排，接着是Ig轻链基因(IgL)重排. 在T 细胞中， TCRδ基因首先重排， 接着是TCRγ， TCRβ与TCRα基因重排. 通过基因重排的机制估计能产生108以上不同的免疫球蛋白与TCR，足够去对抗人类所能遇到的大量抗原. 基因重排过程是一个正常的过程，正常淋巴细胞在发育中是多克隆性质，但淋巴造血系统肿瘤所具有的是单克隆性重排，也就是全部肿瘤细胞具有一个相同的免疫球蛋白或TCR 基因重排，即表现为重排基因为单一模式. 应用PCR方法［4］，根据其核苷酸序列设计引物， 对其基因进行扩增，扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶（或琼脂糖凝胶）电泳中分离，银染色，紫外灯下观察结果，正常淋巴组织由于是多克隆性质，重排方式极多，所以PCR产物呈一片弥漫带，出现多条非特异带. 而肿瘤呈单克隆性增殖，在电泳中会出现单一或少数特异带. 这种特异性使得每一类患者具有其独特的克隆标志，可以用来作为肿瘤诊断和检测微小病灶的依据. 这对研究淋巴细胞恶变的机制和解决临床的诊断问题都十分重要. 检测单克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因有助于鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生，并确定细胞的来源.
　　
　　根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkins disease， HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（non Hodgkins malignant lymphoma， NHL），NHL大体病变特点包括4种类型［5］：①脾脏孤立性巨块型占位；②脾脏多结节肿块；③脾脏弥漫粟粒状肿大； ④ 脾脏均匀肿大，未见明显占位性病变. 淋巴瘤细胞的特点决定了大体改变，本例B细胞性滤泡性淋巴瘤为后两种表现， 因其具有滤泡生长能力或倾向，多形成粟粒结节. 由于结构特殊和类型复杂，脾脏淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，对脾脏淋巴瘤的诊断，除少数典型大细胞性淋巴瘤以及比较有特点的肿瘤(如典型肝脾TCL) 外，定性及分类较困难. 特别是小B细胞淋巴瘤的诊断与鉴别诊断是难点，免疫组化在确定类型上有很大帮助［6］. 我们应用B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，证实1例原发性脾脏恶性淋巴瘤不同部位肿瘤组织具有相同的基因重排结果， 提示基因重排的检测对于识别此类脾脏交界性病变及淋巴瘤的早期发现可能具有重要价值. 鉴别诊断: ①反应性滤泡增生（FH）；②错构瘤；③组织细胞肉瘤与噬血细胞组织细胞增生症. 免疫组化和基因重排检测可以区别.
　　致谢感谢王娟红、黄高升和尚凤霞大夫的帮助.
基金项目：国家自然科学基金（30171052）; 国家回国人员研究启动基金（Hg98004）; 陕西省卫生厅科研基金（02D02）

参考文献

　　［1］Garcia MJ， Delgado BM， Granizo JJ， et al. IgH， TCRγ and TCRβgene rearrangement in 80 B and Tcell NonHodgkins lymphomas: Study of the association between proliferation and the socalled“A berrant”patterns［J］. Diag Mol Pathol， 2001， 10(2): 69-77.

　　［2］王淑芳，苏勤，朱少君，等．多发性子宫平滑肌瘤的克隆性［J］．中华病理学杂志，2002， 31:107-111.

　　［3］朱少君， 苏勤， 王淑芳， 等. 女性外阴尖锐湿疣的克隆性［J］. 诊断病理学杂志， 2003， 10:81-84.

　　［4］Derksen PW， Langerak AW， Kerkhof E， et al. Comparison of different polymerase chain reaction based approaches for clonality assessment of immunoglobulin heavychain gene rearrangements in B cell neoplasia ［J］. Mod Pathol， 1999， 12(8): 794-805.

　　［5］张丽， 李百周， 徐天蓉， 等. 脾脏非霍奇金淋巴瘤临床病理学研究［J］. 临床与实验病理学杂志， 2003， 19(1):43-47.

　　［6］Pittaluga S， Verhoef G， Criel A， et al. Small Bcell nonHodgkins lymphomas with splenomegaly at presentation are either mantle cell lymphoma or marginal zone cell lymphomas. A study based on histology， cytology， immunohistochemistry， and cytogenetic analysis［J］. Am J Surg Pathol， 1996， 20: 211-223.

转贴于