关于HIF1α基因表达下调对人结肠癌SW480细胞增殖和VEGF表达的影响

【摘要】 目的: 研究转录因子缺氧诱导因子1α（HIF1α）在缺氧条件下对人结肠癌SW480细胞增殖的作用，以及HIF1α对血管内皮生长因子（VEGF)表达的影响，研究HIF1α调节SW480细胞增殖的机制. 方法: 构建针对HIF1α的pSuperEGFP siRNA表达载体，转染SW480细胞，抑制HIF1α的表达，RTPCR和Western Blot检测抑制结果；MTT法检测HIF1α被抑制后，SW480在缺氧培养条件下的增殖情况；RTPCR和Western Blot检测VEGF 的表达. 结果: 缺氧培养条件下，HIF1α和VEGF表达明显上升；转染pSuperEGFP siRNA表达载体后，SW480细胞HIF1α mRNA和蛋白质的表达大幅下降；SW480细胞增殖下降（P&<0.05）； 而在缺氧培养条件下有较高表达的VEGF，其mRNA和蛋白质的表达也大幅下降. 结论: HIF1α在缺氧条件下，对SW480细胞在增殖有影响，其机制可能是通过在缺氧时上调节VEGF等细胞生长因子的表达，进而调节肿瘤细胞生长.
【关键词】 缺氧诱导因子 血管内皮生长因子类 RNA干扰 SW480细胞增殖
　　0引言
　　缺氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor1， HIF1)是调节肿瘤细胞缺氧反应的主要转录因子. HIF1α是决定HIF1活性的亚单位，其在许多肿瘤中高表达，与肿瘤高度侵袭性、易转移、对放化疗不敏感和预后不良密切相关［1］；同时HIF1α与肿瘤细胞增殖、细胞凋亡、糖代谢、血管生成有紧密联系［2］. 以HIF1α为靶点的抗肿瘤治疗正成为许多基础和临床研究的热点. RNA干扰( RNA interference， RNAi) 是一种封闭基因表达的有效方法. 为探讨以HIF1α在SW480细胞增殖中的作用，及以HIF1α靶点的RNA干扰对结肠癌的作用， 我们构建了针对HIF1α的短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）表达载体，抑制其表达，研究HIF1α表达被抑制后，SW480细胞增殖及其VEGF表达的变化.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　脂质体LipofectamineTM 2000购自Invitrogen公司；兔抗HIF1α多克隆抗体、VEGF多克隆抗体购自Santa Cruz公司，羊抗兔HRP二抗购于北京中杉金桥公司；逆转录试剂盒和T4 DNA连接酶购自MBI公司；Tag聚合酶和TRIZOL试剂购自Gibco公司；蛋白酶抑制Cocktail购于Sigma公司；PVDF膜购自Millipore公司；ECL试剂盒购于Pierce公司；HIF1α靶shRNA和无义对照的DNA寡核苷酸链和PCR引物由博士德公司合成；pSUPEREGFP siRNA表达载体由第三军医大学陈春霖博士赠送. SW480细胞株由四川大学华西医院肿瘤生物治疗研究室赠送.
　　1.2方法
　　1.2.1细胞常氧和缺氧培养
　　SW480细胞在含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640中培养（37℃，210 mL/L O2，740 mL/L N2，50 mL/L CO2）；低氧条件建立：将生长状态良好的SW480细胞置于三气培养箱中低氧培养(10 mL/L O2，50 mL/L CO2，940 mL/L N2)，模拟肿瘤组织缺氧微环境.
　　1.2.2人HIF1α siRNA表达载体的构建
　　根据文献［3］报道，合成构建人HIF1α siRNA表达载体的一对互补19 nt寡核苷酸链，两端带有Bgl II和Hind III酶切位点.siRNA和无义对照序列都在GenBank database进行BLAST检索，所设计的siRNA序列仅仅与人HIF1α序列相配，而无义寡核苷酸对照链顺序不与任何人基因序列相配.
　　将正义和反义寡核苷酸链各1 nmol在50 μL退火缓冲液中退火，退火程序按95℃ 4 min，70℃ 10 min，缓慢冷却至室温，形成带酶切位点的寡核苷酸双链. 取0.02 nmol退火双链与200 ng pSUPEREGFP载体，在含T4 DNA连接酶的20 μL反应体系中，室温连接6 h. 重组体转化DH5α感受态细菌，筛选Kan+抗性克隆，抽提质粒，BglⅡ和HindⅢ双酶切后琼脂糖电泳检测，测序分析验证.
　　1.2.3细胞转染和筛选SW480细胞计数1×105接种于六孔板，培养至90%融合，在LipofectamineTM2000脂质体介导下进行HIF1α shRNA表达载体和无义shRNA表达载体的转染，空白对照组孔内加入含相同浓度脂质体的RPMI 1640培养液. 6 h后移去含脂质体的培养液，换为含100 mL/L血清的RPMI 1640培养液继续培养. 48 h恢复生长后，用含200 g/L G418的培养液筛选6 d，再用含G418 400 mg/L 的培养液筛选3 d，换含200 g/L G418的培养液继续扩大培养，进行后续操作或冻存.
　　1.2.4半定量RTPCR检测TRIZOL法提取各组细胞的总RNA并定量；各样本取1 μg总RNA，按MBI公司试剂盒说明进行逆转录；取cDNA5 μL/样本，常规PCR反应，GAPDH为内对照. PCR引物如下：HIF1α上游5′CTGACCCTGCACTCA ATCAA3′，下游5′CTTTGCTTCTGTGTCTTCAGCAGC A3′（245 bp）；VEGF上游5 ′ATGAACTTTCTGTCTTG3′，下游5 ′TGCATGGTGATGTTGGAC3′（382 bp）；GAPDH上游5′ACCACAGTCCTGCATGCCATCAC3′，下游5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′（450 bp）. 20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，Gene GENIUS凝胶成像系统扫描条带灰度值并进行分析，每组检测5个样本，RTPCR产物比值=(HIF1α（VEGF）mRNA灰度值/内对照GAPDH mRNA灰度值)×100%.
　　1.2.5Western Blot检测冷PBS液洗细胞一次，用含Cocktail蛋白酶抑制剂的冷RIPA细胞裂解液收获蛋白，Bradford法定量，70 μg/泳道进行SDSPAGE；以100 V，90 min将蛋白转移至PVDF膜；封闭液（含5 g/L脱脂奶粉)封闭2 h，加入一抗(1∶400， V/V) 4℃过夜，二抗(1∶1500，V/V)室温下杂交45 min，洗膜后用ECL试剂盒进行发光反应，压片、显影、定影，观察蛋白印迹.
　　1.2.6MTT试验将细胞接种于96孔细胞培养板，每孔1×104个细胞，细胞贴壁后缺氧培养24 h，分别加入MTT，于酶标免疫测定仪上测其A490值， 具体方法见文献. 分别设空白对照组、无义siRNA组、有义siRNA组，每组均设6个平行孔，并重复3 次(批)实验. 细胞存活率=（实验组A值/对照组A值）×100%.
　　统计学处理：A值用x±s表示，采用SPSS11.5统计分析软件对数据进行分析，不同组间比较采用单因素方差分析， P&<0.05表示有统计学意义.
　　2结果
　　2.1RNA干扰抑制SW480细胞HIF1α的表达
　　缺氧24 h后，SW480细胞HIF1α mRNA表达与常氧条件下相同，均有较高表达. 稳定转染HIF1α siRNA表达载体后(图1，2)，SW480细胞HIF1α mRNA的表达明显被抑制(28.7±3.5)，而无义siRNA载体组没有明显变化(87.8±3.1），二者差异显著(P&<0.01，n=5). HIF1α蛋白在常氧条件下表达微弱，缺氧培养24 h后表达量显著上升. 稳定转染后缺氧培养，HIF1α siRNA正义组HIF1α蛋白的表达明显下调，而无义siRNA载体组和空白HIF1α蛋白表达没有变化（图3），结果显示HIF1α蛋白质表达受低氧诱导，而HIF1α siRNA表达载体转录的siRNA通过降解HIF1α mRNA，有效抑制其蛋白合成.
　　2.2HIF1α表达抑制后对VEGF的影响
　　如图2，4所示在常氧条件下培养的SW480细胞中，VEGF mRNA的表达较低. 缺氧24 h后，其表达有明显的升高；HIF1α siRNA表达载体稳定转染细胞在缺氧培养24 h， VEGF mRNA的表达也明显随HIF1α下降(41.0±3.4)；而无义siRNA载体组VEGF mRNA表达变化不明显（84.4±4.5），二者有明显的差别（P&<0.01，n=5）.
　　SW480细胞缺氧后，VEGF 蛋白表达有明显的升高；但当HIF1α的表达被抑制后，VEGF蛋白的表达也明显下降；而无义siRNA载体组VEGF蛋白表达没有变化（图5），显示HIF1α的表达被抑制后，VEGF蛋白水平被有效的下调，说明缺氧条件下HIF1α是VEGF表达的调控因子，HIF1α被抑制能下调VEGF的表达. 　2．3HIF1α RNA干扰对SW480细胞增殖的影响
　　在缺氧24 h后，MTT检测结果显示，HIF1α有义siRNA组细胞A值（0.67±0.07）明显低于HIF1α无义siRNA组(1.05±0.04)， 空白对照组细胞A值最高（1.15±0.04），HIF1α有义siRNA组与两对照组比较有明显差异. 以空白组的细胞存活率为1，HIF1α有义siRNA组细胞存活率明显低于HIF1α无义siRNA组和空白对照组，说明在缺氧环境中，HIF1α对细胞增殖有调控作用.
　　3讨论
　　目前HIF1α在细胞增殖和调亡中所起的作用仍存在争议. 有研究报道HIF1α抑制凋亡，促进增殖，促进肿瘤发生［4］. HIF1α 体内、体外转染均可促进肺癌A549细胞的生长，其机制与其能促进细胞恶性增殖和抑制凋亡有关［5］. 而另一方面，也有报道证实HIF1α能稳定p53，从而促进细胞凋亡［6］. 不同的研究结果提示HIF1α可能在不同的细胞系中分别发挥促进或抑制凋亡的作用. 本研究结果表明HIF1αRNA干扰对SW480细胞的增殖有抑制作用，提示在人结肠癌细胞中HIF1α有促进细胞增殖的作用.
　　血管内皮生长因子（VEGF）是HIF1的下游调控基因，当细胞处于缺氧环境时，HIF1表达迅速上升，与靶基因如VEGF基因的启动子或增强子区域相结合，诱导其表达. VEGF是目前已知作用最强的血管形成促进因子，作为旁分泌因子增加微血管通透性，诱导内皮细胞分裂、增殖、迁移，而促进血管形成［7］. 另一方面有研究表明VEGF 不仅作为旁分泌因子刺激血管内皮细胞增殖，同时还作为自分泌因子直接作用于肿瘤细胞自身的VEGF 受体而促进肿瘤细胞生长［8］. 而针对VEGF的RNA干扰能有效抑制人卵巢癌细胞的增殖［8］.
　　我们的实验结果显示:①构建的HIF1αsiRNA表达载体能有效抑制其mRNA和蛋白质的表达；②当HIF1α表达被抑制后，VEGF mRNA和蛋白质的表达随之明显下调；③HIF1α表达被抑制后，SW480细胞的增殖有一定程度的抑制，这种抑制有可能与VEGF表达下调有关. 我们的研究结果显示，针对HIF1α的RNA干扰能有效抑制SW480细胞的增殖和VEGF的表达，提示HIF1α作为肿瘤缺氧应答中心因子，在结肠癌基因治疗中是一个有效的靶点，RNA干扰技术有较好的应用前景.

参考文献

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