乳腺癌SLN中CD8+T细胞及DC的动态浅析

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　　　　　　　　 作者：何建军，任予，霍永平，张云锋，王珂，陈武科

【关键词】 西安交通大学医学院第一附属医院肿瘤外科，陕西 西安 710061
　　【Abstract】 AIM: To analyze dynamically the changes of CD8+T cells and dendritic cells (DC) in sentinel lymph node (SLN) in breast cancer. METHODS: A total of 82 SLN， from 31 breast cancer patients undergoing the SLN biopsy from April 2001 to June 2003， were examined in the study. Of the 31 patients， 12 had micrometastasis in SLN observed through the detection of CK19 mAb， 9 were proved of nonmetastasis in SLN and the other 10 had metastasis found by HE staining. With SABC immunohistochemistry for CD8 mAb and S100 polyclonal antibody， we got the ratios of positive cell numbers to total lymphocyte number in 5 highpower fields and counted their average. RESULTS: Among the 82 SLN， nonmetastasis was found in 35 SLN， micrometastasis in 20 SLN， and metastasis in 27. The average ratios of CD8+T cells and S100+ DC to total lymphocyte were different significantly among the 3 groups (P&<0.01). CONCLUSION: Tumor metastasis in SLN in breast cancer， even micrometastasis， would lead to the notable decrease of CD8+ T cells， while it would not result in the obvious change of DC number， except that the remarkable metastasis would reduce the DC.
　　【Keywords】breast neoplasms; sentinel lymph nodes (SLN); CD8positive Tlymphocytes; dendritic cells
　　【摘要】目的： 分析乳腺癌SLN中CD8+T细胞及DC的变化规律. 方法： 自200104/200306所进行的乳腺癌SLN活检病例中，选择应用CK19 mAb检测到SLN具有微转移的患者12例，并随机选择无转移的9例，HE有转移的10例共82个SLN. 将82个SLN分为无转移、微转移及转移组；选择CD8单抗及S100多抗，采用免疫组化SABC，计数5个高倍视野下阳性染色细胞数和淋巴细胞总数的比值，取其平均值，得出阳性细胞百分比率. 结果： 82个SLN中未转移35个，微转移20个，转移27个；三组淋巴结中CD8+T细胞和S100+ DC占总淋巴细胞的比率有统计学差异（P&<0.01）. 结论： 乳腺癌SLN中一旦出现肿瘤转移，即使是微转移，也能使CD8+T细胞的数量明显减少；SLN出现微转移对DC数量无明显影响，而一旦出现明显转移，则可使DC的数量显著减少.
　　【关键词】 乳腺肿瘤；前哨淋巴结；CD8阳性T淋巴细胞；树突细胞
　　0前言
　　Alessandro［1］认为肿瘤区域引流淋巴结是抗肿瘤免疫反应产生的初始和主要部位，在其中可出现一系列的肿瘤免疫反应. 前哨淋巴结（SLN）是区域淋巴引流的第一位点，从肿瘤组织引流的物质可能首先到达SLN中. 我们采用免疫组化的方法，观察乳腺癌SLN中在无转移、微转移及转移状态下 CD8+T细胞及S100+DC的动态变化规律.
　　1对象和方法
　　
　　1.1对象200104/200306，采用前哨淋巴结活检方法［2］，选择应用CK19 mAb（武汉博士德公司）检测到具有微转移的患者12例，并随机选择无转移的9例，HE有转移的10例共82个SLN，再次应用常规病理及CK19 mAb检测微转移. 将82个SLN分为无转移、微转移及转移组；所有的患者术前均未接受化疗或放疗. 鼠抗人人CD8 mAb和鼠抗人S100多抗（Novocastra Laboratories Ltd， UK）.
　　1.2方法采用免疫组化SABC法，每批实验均设阴性对照（PBS液替代一抗）和阳性对照（人扁桃体组织）. 染色过程：脱蜡水化、抗原修复、封酶、每张切片滴加50 μL左右一抗（CK19mAb1∶100倍稀释、CD8mAb及S100多抗1∶50倍稀释），37℃孵育90 min，PBS冲洗，5 min×3次；每张切片滴加50 μL左右的生物素标记的二抗（兔抗鼠的IgG），37℃孵育30 min，PBS冲洗，5 min×3次；然后滴加链霉卵白素生物素复合物，37℃孵育20 min；再加50 μL左右的增强剂，37℃浸泡20 min，PBS冲洗，5 min×3次；再滴加链霉卵白素辣根过氧化物酶，37℃孵育20 min，PBS冲洗，5 min×3次；然后每张切片滴加新配制的DAB显色液，镜下观察控制显色反应；苏木素复染核6 min，自来水冲洗，中性树胶封片. 观察标准： ① 选择免疫组化染色阳性细胞密集区域，取5个高倍视野（×400），以目镜测微网计数阳性染色细胞数和淋巴细胞总数，取其平均值，得出阳性细胞占总淋巴细胞数的百分比率. ② 微转移的判断标准：HE未发现转移，应用CK19 mAb行免疫组化，在SLN中发现单个肿瘤细胞或肿瘤细胞团直径小于2 mm的转移灶.
　　统计学处理： 不同转移状态下SLN的阳性细胞用平均比率x±s表示. 所有数据均经SPSS10.0统计软件包处理，包括方差齐性分析（显著性水准双侧α=0.05），t检验（显著性水准双侧α=0.01），单因素方差分析（显著性水准双侧α=0.01）.
　　2结果
　　
　　本实验82个乳腺癌SLN，无转移35个，微转移20个，转移淋巴结27个.
　　2.1CD8+T细胞在SLN中的表达CD8主要表达在淋巴细胞胞膜上，部分胞质内有少许表达（图1）. 经免疫组化染色后阳性产物呈弥漫的黄色、棕黄色颗粒. 无转移、微转移及转移SLN中CD8+T细胞占总淋巴细胞的比率分别为8.2±1.6，5.3±1.6和4.7±2.3，单因素方差分析显示三组存在统计学差异（F=31.406， P&<0.01）. LSDt检验进行三组间均数的多重比较，无转移组与微转移组、无转移组与转移组CD8+T细胞占总淋巴细胞的比率有显著性差异（P&<0.01），而微转移组和转移组无统计学意义（P=0.274）. 说明SLN在无转移状态时CD8+T细胞的数量明显多于出现微转移和转移时，而微转移和转移时CD8+T细胞的数量无明显变化.
　　A： 未转移；B： 微转移；C： 转移.
　　图1CD8+T细胞在乳腺癌SLN中的表达×400（略）
　　2.2S100+细胞在SLN中的表达S100+主要表达在淋巴细胞胞膜上，部分胞质内亦有表达；经免疫组化染色后阳性产物呈弥漫的黄色、棕黄色颗粒（图2）. 无转移、微转移及转移SLN中S100+细胞占总淋巴细胞的比率分别为4.1±1.6，3.5±1.7和2.5±1.1；三组存在统计学差异（F=9.171， P&<0.01）. LSDt检验进行三组间均数的多重比较，无转移组与微转移组差异无统计学意义，而它们均与转移组的差异具有统计学意义. 说明SLN在无转移和微转移状态时，S100+细胞标记的DC数量相等；而一旦出现转移， DC的数量明显减少.

　　A： 未转移；B： 微转移；C： 转移.
　　图2S100+细胞在乳腺癌SLN中的表达×400（略）
　　3讨论
　　CD8+T细胞是一种细胞毒T 细胞，主要产生特异性细胞免疫. 在肿瘤引流淋巴结的肿瘤免疫研究中，CD8+T细胞也是一个主要研究的免疫细胞. Lores等［3］通过T淋巴细胞的多种膜标志包括CD8+T细胞来研究肿瘤引流淋巴结中的肿瘤免疫，发现在引流淋巴结中肿瘤转移出现的早期呈现强烈的免疫反应，但不久就下调了. 这一结果在本实验中得到验证，CD8+T细胞占总淋巴细胞数的比率在无转移组与微转移组间有明显差异，而微转移组与转移组间未显示差异. 王水等［4］采用流式细胞技术比较乳腺癌SLN 与非SLN中免疫功能，发现肿瘤未转移时，SLN的CD8+T细胞数量与非SLN 差异无显著性；而当肿瘤转移时，SLN 和非SLN的T细胞的比例发生显著性改变，由正常的以CD4+T细胞为主，转变为以CD8+T 细胞为主. 该结果似乎与本研究结果相反，考虑除与不同研究方法以及样本量偏小有关外，本研究结果显示无转移、微转移及转移的SLN中，CD8+T细胞占总淋巴细胞的比率呈现递减趋势，而非比较的SLN中的CD8 +T细胞数量，以后研究中SLN淋巴细胞群谱的描绘将有助于解释这两个研究结果的不同.
　　
　　IDCs位于淋巴组织T细胞区，由LC移行至淋巴结而来，高表达MHCⅠ， MHCⅡ类分子和S100蛋白，具有较强的免疫激活作用. DC在成熟过程中，同时发生迁移，由外周组织通过淋巴管和（或）血液进入次级淋巴器官，然后激发T细胞应答. Sakakura等［5］认为区域淋巴结中树突细胞密度、数量的变化反映了机体抗肿瘤能力的变化，树突细胞减少是机体全身或局部淋巴结中免疫力下降所致. 因此，局部淋巴结中DC的密度、数量可能更好地反映机体抗肿瘤免疫力. Huang等［6］应用免疫组化的方法研究乳腺癌SLN和非SLN中S100+DC的变化规律，发现SLN中DC的密度以及DC的计数明显低于非SLN中，从而认为是肿瘤导致DC的数量减少. 本研究显示在SLN处于微转移状态时S100+DC的数量与无转移状态时无明显的差异，但当SLN出现明显转移时，S100+DC的数量则明显减少，具有统计学意义. 说明微转移状态对DC数量的影响不明显，而一旦出现明显转移，则可明显使DC的数量减少，从而使细胞免疫受到抑制.
　　
　　从上述两种细胞数量的改变，我们发现，随着SLN中肿瘤转移的逐渐出现，细胞免疫逐渐受到抑制，呈现一个动态的变化过程. 我们计划从分子生物学的水平来进一步研究SLN中免疫细胞的功能改变，以从肿瘤引流淋巴结的角度更加深入的认识肿瘤免疫抑制的机制.
【参考文献】
　　［1］ Alessandro DS. Lymph node metastasesthe importance of the microenvironment［J］. Cancer， 2000，88(1):175-180.

　　［2］ 何建军，任予，陈武科，等. 专利蓝与99mTC硫化锑胶体联合鉴别乳腺癌SLN［J］. 中国现代医学杂志，2004，14（20）：39-40.

　　［3］ Lores B， GarciaEstevez JM， Arias C. Lymph nodes and human tumors［J］. Int J Mol Med， 1998，1(4):729-733.

　　［4］ 王水，范萍，武正炎. 乳腺癌前哨淋巴结淋巴细胞亚群的初步研究［J］. 中华肿瘤杂志， 2004，26(4):220-222.

　　［5］ Sakakura K， Chikamatsu K， Sakurai T， et al. Infiltration of dendritic cells and NK cells into the sentinel lymph node in oral cavity cancer［J］. Oral Oncol， 2005，41(1):89-96.

　　［6］ Huang RR， Wen DR， Guo J， et al. Selective modulation of paracortical dendritic cells and Tlymphocytes in breast cancer sentinel lymph nodes［J］. Breast J， 2000，6(4):225-232.