关于曲古菌素A和ATRA合用对PLZFRARα转基因阳性发病鼠骨髓细胞的诱导分化作用

　　　　　　　　　　作者：陈思宇，董颖，陈丽娟，张龙，王龙，陈强，王振义

　　【Abstract】 AIM: To investigate the effect of alltrans retinoic acid (ATRA) in combinetion with trichostatin A (TSA)， a histone deacetylase inhibitor， on PLZFRARαpositive cells. METHODS: Molecular cloning technology was used to construct hCGPLZFRARα gene. HCGPLZFRARα transgenic mice were generated， in which PLZFRARα fusion gene was driven by hCG promoter to express in myeloid cells of mice. The genotype and phenotype were analyzed by PCR， Southern Blot， RTPCR， immunofluorescence， morphology of bone marrow cells， peripheral blood cells and spleen cells， pathology of bone， spleen and liver. Bone marrow leukemia cells were cultured in vitro. The change of cell morphology was observed by WrightGiemsa staining; cell cycle distribution and expression of cell membrane surface differentiationrelated antigens (such as CD11b， CD117 and Gr1) were determined by flow cytometry assay. Expression of PLZF was analyzed by immunofluorescence. Functional differentiation was reflected by nitroblue tetrazolium(NBT) reduction ability. RESULTS:Some hCG PLZFRARα transgenic mice developed leukemia resembling human chronic myeloid leukemia. After treated with TSA and RA， bone marrow leukemia cells presented morphologically some features of differentiated cells; the cell growth and proliferation were inhibited in a timedependent manner. The proportion of cells in S phage was decreased. The expression of PLZF relocated in treated cells. However， no significant difference in NBT assay was documented with the combination therapy. CONCLUSION: Combination of histone deacetylase inhibitor with ATRA can cause a partial differentiation of PLZFRARα positive cells.
　　【Keywords】 PLZF; RA; transgene; histone deacetylase; differentiation; leukemia， promyelocytic， acute
　　【摘要】 目的： 研究组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(trichostatin A，TSA)和ATRA对PLZFRARα转基因发病鼠骨髓细胞的作用. 方法： 分子克隆技术构建hCGPLZFRARα转基因构件. 显微注射建立仅在髓系细胞中表达PLZFRARα的转基因小鼠模型. DNAPCR，Southern blot，RTPCR，免疫荧光，血象，骨髓象，脾细胞形态，病理等检测分析基因整合表达及发病情况. 取PLZFRARα转基因发病鼠骨髓细胞体外培养，经TSA和ATRA作用一段时间后，WrightGiemsa 染色观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞周期、细胞表面分化抗原CD11b和CD117等的表达，荧光免疫细胞化学染色检测融合蛋白表达，硝基蓝四氮唑(NBT)还原试验观察细胞功能分化情况. 结果： TSA(30 μg/L)联合ATRA(1 μmol/L)使发病鼠骨髓细胞核质比缩小，幼稚细胞比例减少，细胞生长增殖受抑，S期细胞减少，PLZF蛋白的表达呈局部聚集的趋势，但NBF还原试验变化尚不明显. 结论： 组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA联合ATRA可使PLZFRARα转基因发病鼠骨髓细胞发生部分分化.
　　【关键词】 PLZF；维甲酸；转基因；组蛋白去乙酰化酶；分化；白血病，早幼粒，急性
　　0引言
　　
　　在诱导肿瘤细胞分化方面，急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia， APL)为人们提供了一个理想的研究模型［1］. 约95% APL患者的白血病细胞中携带有非随机染色体易位t(15;17)(q22;q21)，形成PMLRARα融合基因，成为APL特征性的分子标志. 少数变异型APL患者携带t(11;17) (q23;q21)，表达PLZFRARα融合蛋白. PMLRARα和PLZFRARα两种融合基因的产物均能阻断维甲酸信号传导通路，但二者对全反式维甲酸(alltrans retinoic acid， ATRA)的反应却表现出明显不同，即表达PMLRARα的APL患者对ATRA敏感，而表达PLZFRARα的患者对ATRA不敏感. ATRA和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor， HDACi）曲古菌素A(trichostatin A， TSA)联合治疗可以诱导PLZFRARα阳性APL细胞发生分化［1］. 我们利用建立的PLZFRARα融和基因在小鼠髓系细胞特异表达的hCG PLZFRARα转基因鼠(transgenic mice， TM)模型，在生物水平研究了TSA联合维甲酸对PLZFRARα 阳性白血病细胞的诱导分化作用.
　　1材料和方法
　　1.1材料TM的建立参照文献［2］. 本研究所已经构建了hCGPLZFRARα载体，将此质粒转化大肠杆菌，氨苄青霉素LB平板筛选出阳性克隆，获得的质粒经酶切及测序验证后，用Qiagene纯化柱大量提取质粒，经SalI， PvuI酶切完成质粒线形化，纯化得到转基因构件. 将转基因构件显微注射到受精卵雄原核，植入假孕母鼠，小鼠出生后2 wk进行整合鉴定. SPF级C57BL/6J， B6DBA小鼠由上海南方模式生物研究中心繁育，获得的TM在上海第二医科大学动物科学部SPF级动物房饲养. TSA (Sigma)溶解于无水乙醇， 配成1 g/L储存液， 用时以培养液稀释成10 mg/L工作液. ATRA (Sigma)溶解于无水乙醇， 配成10 mmol/L储存液， 用时以培养液稀释成100 μmol/L工作液.
　　1.2方法
　　1.2.1基因整合检测

参考文献

方法［2］进行基因整合的检测. 剪取TM的尾巴约1 cm，抽提得到基因组DNA，紫外分光光度计测定A值并定量，每次反应以100 ng DNA为模板运用PCR对PLZFRARα TM基因整合进行检测. 取反应产物行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察，摄片. 取全部基因组PCR鉴定阳性的G0代TM进行基因组Southern blot分析，BioRad磷屏放射自显影1~2 d后扫描，所得结果根据条带大小确定融合基因是否整合到小鼠基因组中.
　　1.2.2RTPCR检测TM中PLZFRARα的表达颈椎脱臼法处死小鼠，用RPMI1640 (Gibco)培养液冲洗小鼠股骨及胫骨收集骨髓细胞，Trizol 抽提细胞总RNA. 紫外分光光度计(Beckman DU600)对RNA定量并检测A260/A280鉴定其纯度，10 g/L甲醛变性琼脂糖凝胶电泳判断RNA的完整性，RTPCR检测PLZFRARα融合基因. 由于所检测的融合基因PLZFRARα是cDNA，为避免基因组DNA污染造成的假阳性结果，所设计的引物跨越了载体hCG的第一个内含子. 取反应产物行12 g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，摄片.
　　1.2.3免疫荧光检测融合蛋白表达取TM骨髓或脾脏细胞，涂片，-20℃预冷甲醇/丙酮(1∶1)固定液浸泡固定5~10 min， PBS浸洗，30 g/L BSA封闭，一抗(goat antiPLZF， Santa Cruz)室温孵育1 h，PBS洗5 min×5次，二抗(FITCrabbit antigoat IgG) 室温孵育1 h，PBS洗5 min×5次，碘化丙啶(PI)复染，封片，激光共聚焦显微镜下观察.
　　1.2.4小鼠血象、骨髓象、脾脏细胞形态学及病理检查鼠尾采血，测血象；制备外周血涂片，WrightGiemsa染色，显微镜下观察细胞形态并计数白细胞分类. 颈椎脱臼法处死小鼠，RPMI1640培养液冲洗股骨及胫骨，取得骨髓、脾脏细胞，用PBS冲洗， WrightGiemsa染色，显微镜下观察细胞形态，计数200个细胞得出有核细胞分类. 取小鼠肝脏、脾脏、胫骨及肺脏，石蜡包埋，作HE染色，镜下观察病理变化.
　　1.2.5骨髓细胞的收集培养和检测无菌操作取小鼠骨髓细胞，加入红细胞裂解液(Sigma)去除成熟红细胞，PBS洗涤2次，细胞悬浮于含100 mL/L胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培养液中， 在含950 mL/L空气: 50 mL/L CO2的37℃饱和湿度环境下培养. 在培养基中分别加入1 μmol/L ATRA和/或5 μg/L TSA，培养12 h后收集细胞，离心涂片（500 r/min， 5 min），WrightGiemsa染色，显微镜下观察细胞形态，计数200个细胞得出有核细胞分类. 取约1×106细胞，PBS洗涤，750 mL/L冷乙醇4℃固定过夜，PBS清洗，加入Rnase (终浓度200 mg/L)消化， 20 mg/L PI 染色，孵育30 min，用流式细胞仪(BeckmonCoulter， Miami， Florida)检测细胞不同DNA含量分布，经Multicycle软件分析细胞周期和凋亡细胞. 取细胞悬液100 μL（约含5×105细胞），加入FITC或PE标记的抗体，流式细胞仪检测小鼠骨髓造血干祖细胞标志CD117，髓系祖细胞标志CD34，髓系晚期标志CD11b和Gr1. 取约1×106细胞，PBS清洗后加入硝基蓝四氮唑 (NBT)反应液，37℃孵育30 min，混悬细胞，离心涂片，光镜下计数阳性细胞率，每个视野至少计数200个细胞.
　　2结果
　　2.1PLZFRARα转基因鼠的建立我们获得了在hCG基因5′侧翼区和第1外显子之间插入的PLZFRARα 融合基因的转基因构件，全长11.3 kb，其中PLZFRARα融合基因长度为3 kb. 分别对100余只显微注射后的小鼠进行基因组PCR整合检测，双盲法重复鉴定一次. 选取2次整合鉴定均为阳性的小鼠进行Southern blot 分析. 用获得PLZFRARα转基因阳性G0代小鼠与正常同品系小鼠交配，建立了PLZFRARα TM单系.　　
　　取不同单系PLZFRARα整合阳性小鼠，收集骨髓细胞，用RTPCR法检测融合基因的表达情况. 以野生型小鼠为对照，管家基因GAPDH作为内参. 为排除基因组DNA的干扰，设计的引物跨越hCG基因的第1个内含子. 结果6个单系的PLZFRARα阳性小鼠中有4个单系子代小鼠骨髓细胞的RTPCR产物经电泳后出现503 bp的特异性融合基因条带，而另外两个建系小鼠尽管可检测到融合基因片断的插入，但外源基因的表达却是阴性的. 所有被检测小鼠均出现455 bp的内参条带. 免疫荧光检测PLZF蛋白的表达，发现转基因阳性发病鼠的表达明显强于阴性鼠. PLZF蛋白的分布以胞浆为主，核内有较弥散分布. 阴性鼠只有少数细胞有较强的荧光表达(图1).
　　A: PLZFRAR α (-); B:PLZFRAR α (+) . 1： PLZF蛋白（FITC标记）；2： 细胞核（PI标记）；3： PLZF蛋白（FITC标记）和细胞核（PI标记）.

转贴于 　　图1转基因鼠骨髓细胞PLZF表达(IF×400) （略）
　　2.2PLZFRARα TM发病表现 PLZFRARα转基因发病小鼠的症状类似于人类慢性粒细胞白血病(CML)，小鼠一般在出生后6~12 mo发病. PLZFRARα发病小鼠与同窝阴性鼠相比，明显消瘦、不活泼、弓背、翘毛、四肢苍白，皮肤黏膜有时破溃出血，不经治疗自然病程一般为1~2 mo. 发病鼠外周血白细胞升高，粒细胞与淋巴细胞比例显著增加，一般均达到或超过1∶1（正常小鼠外周血粒淋比为0.13±0.04）；骨髓细胞粒系百分比增高，幼稚细胞比例高于正常值，原粒＋早幼粒细胞比例大于10% 但小于20%，淋系、红系细胞比例明显降低；病理检查发现，发病鼠骨髓腔隙缩小，骨小梁间脂肪组织消失，造血细胞满布，粒系高度增生，以中晚幼粒细胞为主，红系显著减少，几乎消失，巨核细胞增加；脾脏明显增大，脾脏与体质量之比平均为0.029（正常小鼠平均为0.0027），于低倍镜下可见正常结构破坏，红髓和白髓之间的界限消失，高倍镜下白血病细胞呈弥漫浸润，尤以脾包膜下为甚，少数巨核细胞散在其间；肝脏增大不明显，但白血病细胞浸润严重，满布于血窦及周围区域并弥漫分布于肝小叶中.
　　
　　利用流式细胞仪分析骨髓和脾脏细胞表面抗原的改变，结果发现，PLZFRARa转基因发病小鼠骨髓细胞的CD11b表达率升高到75.2%甚至90.0%（正常为39.2%），CD117表达率升高到16.4%（正常为4.1%），CD34阳性率为22.8%（正常为2.4%），Gr1阳性率升高到62.5%（正常为27.6%），与骨髓象粒系大量增生的变化较一致. 正常小鼠脾脏中以淋巴细胞为主，CD11b，CD117，CD34，Gr1阳性率分别为3.4%，0.9%，1.3%和10.7%；而发病小鼠脾脏存在大量白血病细胞的浸润，CD11b，CD117，CD34，Gr1阳性率分别为53.7%，14.8%，13.5% 和40.9%.
　　2.3TSA和ATRA对PLZFRARα TM的影响细胞涂片染色观察可见，PLZFRARα转基因阳性发病小鼠骨髓细胞培养12 h后分类记数，幼稚细胞（原粒+早幼粒细胞）比例为21%，1 μmol/L ATRA处理组幼稚细胞比例有所下降 (18.6%)，5 μg/L TSA处理后幼稚细胞比例为19%，部分细胞发生凋亡 (14%)，TSA和ATRA合用后，明显可见细胞核浆比例减小，幼稚细胞比例为14%，出现18%的凋亡细胞(图2).
　　药物处理后，G2+S期细胞减少，G1期细胞增多. 用1 μmol/LATRA处理12 h后，出现少数subG1期细胞(25.4%). 用5 μg/L TSA处理，半数左右细胞(50.6%)发生凋亡或死亡. 5 μg/L TSA与1 μmol/LATRA合用后，G2期细胞接近于零，凋亡细胞约为52.5%. 单独TSA或ATRA处理12 h后，细胞中PLZF荧光分布无明显变化；二者合用后，PLZF蛋白的表达呈局部聚集的趋势. PLZFRARα TM骨髓细胞NBT阳性率很低（&<2%），TSA或ATRA处理后，阳性率无明显变化.
　　3讨论
　　APL是我们研究肿瘤细胞诱导分化和凋亡的理想模型. t(15;17) APL患者形成PMLRARα合基因，或伴有RARαPML融合基因，ATRA治疗缓解率高. t(11;17) APL患者则形成PLZF RARα和RARαPLZF融合基因. 此外，其他罕见的变异型染色体易位也存在于APL病例中［3］. t(11;17)APL患者对化疗不敏感，单用ATRA不能诱导缓解，预后差，其研究具有重要价值. 由于t(11;17)APL病例数少，目前世界上仅发现十余例，使得其临床研究比较困难. 为此我们建立转基因鼠，运用模式生物体进行研究.
　　A： 骨髓细胞0 h；B： 骨髓细胞体外培养12 h；C： 1 μmol/L ATRA 12 h；D：5 μg/L TSA 12 h；E，F：1 μmol/L ATRA+5 μg/LTSA 12 h.
　　图2PLZFRARα阳性鼠骨髓细胞形态学变化（光镜×1000）（略）
　　我们发现，PLZFRARα阳性发病鼠的骨髓细胞经过TSA联合ATRA处理后，幼稚细胞（原粒+早幼粒）比例下降，细胞核浆比例缩小，G2+S期细胞减少，G1期细胞增多，并出现了较多凋亡细胞，说明TSA联合ATRA对PLZFRARα 阳性白血病细胞有诱导部分分化和促进细胞凋亡的作用. 其机制可能与HDACi可以逆转PLZFRARα抑制基因转录的作用有关［4］. PLZFRARα蛋白中， PLZF部分的POZ结构域和RARα 部分的E区均能与含HDAC在内的核受体共抑制物NCoR紧密结合，使组蛋白去乙酰化，抑制了基因的转录. 1 μmol/L ATRA可诱导RARα部分的E区与NCoR解离， HDACi则可消除POZ位点上结合的NCoR，使核小体组蛋白解除去乙酰化作用，其下游基因的转录作用得以恢复正常.
　　
　　我们应用的PLZFRARα 转基因鼠发生的是类似CML的改变，而不是类似人APL的改变，这可能与APL发病机制有关. 已发现，在人类APL中，t (15;17)APL患者中能同时检测到PMLRARa和RARaPML两种融合基因的仅见于60%~70%的患者，另有30%~40%的病例只能检测到PMLRARa一种融合基因，故一般认为PMLRARa单独存在即可引起APL［5］. 而t (11;17)APL患者一般总能同时检测到PLZFRARa和RARaPLZF，PLZFRARα TM模型发生的类CML的病理改变，RARαPLZF TM模型发生的是髓系增殖性疾病［6］，同时具有PLZFRARα和RARαPLZF的TM病变则类似于APL. 说明RARaPLZF在APL发病中也有重要作用. 但是，也有报道t (11;17)的APL仅为PLZFRARa阳性，而RARaPLZF未检出的病例，维甲酸对其有诱导分化作用，且此作用可被TSA加强［7］. 我们也发现过单独PLZFRARα 阳性TM病变类似于APL，而PLZFRARα/RARαPLZF TM发病也可能与PLZFRARα TM模型CML样改变一致［8］. 这些说明，PMLRARα和PLZFRARα在APL发病中可起重要作用，但可能不是必备因素.

参考文献

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　　［7］ Petti MC， Fazi F， Gentile M， et al. Complete remission through blast cell differentiation in PLZFRARapositive acute promyelocytic leukemia: in vitro and in vivo studies ［J］. Blood， 2002，100(3):1065-1067.

　　［8］ 陈丽娟，董颖，陈思宇，等. PLZFRARα/RARαPLZF转基因鼠发生白血病［J］. 中国实验血液学，2005，13（6）:924-931.