关于抗ricin中和性单抗4C13单链抗体的真核表达及生物活性检测

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　　　　　　　　 作者：郭建巍　冯健男　马骢　扬霄鹏　沈倍奋

【摘要】 目的： 实现基于中和性单抗4C13单链抗体的真核表达，并对其生物学活性进行评价. 方法： 用TRIzol提取抗ricin中和性单抗杂交瘤细胞4C13总RNA，扩增其轻、重链可变区基因，登陆GenBank；用Linker（GGGGS）3将VH和VL连接，用重叠延伸PCR克隆入真核表达载体pCDNA 3.1，用脂质体转染293T细胞，对瞬时表达产物进行生物学活性检测. 结果： 中和性单抗杂交瘤细胞4C13轻、重链可变区基因在GenBank中的登录号为DQ389248和DQ389245，ScFv与ricin可特异性结合，培养上清原液和2倍稀释液的抑制率分别为33.7%和29%；ScFv在ricin浓度为0.01~0.005 ng/mL时可中和ricin 对SP2/0细胞的细胞毒，随着ricin浓度逐渐增大，细胞存活率逐渐减低. 结论： 研究结果为研制基于中和性单抗的其他ricin拮抗剂奠定了重要的理论和实践基础.
【关键词】 ricin；中和性单抗；基因表达；单链抗体
　　【Abstract】AIM: To realize an antiricin neutralizing monoclonal antibodybased ScFv proteins with high biological activity in the pCDNA3.1 vector expression system and to evaluate the neutralizing activities of ScFv. METHODS: The total RNA was obtained by TRIzol from an antiricin neutralizing monoclonal antibody hybridoma cell named 4C13 and heavychain and lightchain variable fragments (VH， VL) were amplified by overlap PCR and accepted by Genbank of NCBI. VH and VL were linked by （GGGGS）3 with a direction of VHlinkerVL and cloned to pCDNA3.1 vector expression system. The biological activities of ScFv obtained from 293T cell culture fluids infected by liposome were evaluated. RESULTS: The accession number of VH and VL genes of antiricin neutralizing monoclonal antibody was DQ389248 and DQ389245. ScFv could bind with ricin specifically. Inhibition percentage of culture liquid of 293T cell without dilution and with 2 times dilution was 33.7% and 29%， respectively. ScFv could neutralize the cytotoxic effects of ricin to SP2/0 cells at the concentration of 0.01-0.005 ng/mL in a nice doseeffect relation. CONCLUSION: The nice biological activities of ScFv have established an important basement for further study of other antiricin neutralizing monoclonal antibodybased antidotes.
　　【Keywords】 ricin; neutralizing monoclonal antibodies; gene expression; ScFv
　　0引言
　　自“9.11”事件后，世界各国开始高度关注生物制剂的恐怖袭击. 在 《禁止化学武器公约》中，ricin 为最严格的控制对象之一. 同时，ricin也是一种被外军武器化的蛋白毒素，美军把ricin作为化学武器的代号为W或WA. 迄今为止，国内外还没有适用于人的、针对ricin中毒的专用特效药，因此研制基于中和性单抗的ricin 单链抗体具有重要的理论和现实意义［1-2］.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　宿主菌大肠杆菌JM109，BL21，真核表达载体pCDNA 3.1，293T细胞均为本室保存；限制性内切酶：EcoRI及HindIII购自New England Biolabs公司； T4 DNA连接酶、AMV 逆转录酶、Oligo(dT)15Primer 和Wizard DNA 纯化试剂盒、pGEMT Easy载体试剂盒为Promega公司产品；TRIzol Reagent购自Invitrogen公司；DNA片段回收试剂盒， DNA末端连接酶（TdT）， Taq DNA 聚合酶， DNA分子量标准DL2000购自TaKaRa公司；焦炭酸二乙酯（DEPC）为Sigma产品；Lipfectamine2000为GIBCO公司产品；DMEM培养基、胎牛血清、羊抗鼠IgG多抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG由本室提供. 用BIOSUN软件设计引物，由上海博亚生物技术公司合成. 信号肽来自本实验室解志刚博士提供的杂交瘤细胞Mt84.66.

　　1．2方法
　　1.2.1PCR 引物主要用于扩增抗体IgG1重链Fd部分(VH+CH1)；轻链κ链(VL+CL)的全长基因.
　　1.2.2RNA的提取及RTPCR取生长状态良好的4C13杂交瘤细胞(5×106/mL)，用TRIzol提取总RNA，取1 μg含总RNA的溶液，依次加入AMV 5×缓冲液 4 μL，Oligo(dT)（500 ng/μL）0.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2 μL，Rnasin (50 U/μL) 0.5 μL，去离子水补至20 μL，反转录酶2~5 U，42℃延伸1 h. 95℃变性5 min，置冰浴中，产物为cDNA第一链. PCR参数：95℃变性2 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min.
　　1.2.3用于扩增ricin 单链抗体的引物以VHlinkerVL的顺序通过两对特异性引物，用重叠延伸PCR用（GGGGS）3连接VH和VL，并合成新的小分子抗体基因. 通过分析真核表达载体PCDNA3.1和4C13轻、重链可变区基因序列，运用计算机辅助设计的RNA二级结构预测和偏性密码子计算等手段，在目的基因的5′端引物引入HindⅢ酶切位点，3′端引物引入EcorⅠ酶切位点和终止密码子TAA序列. 以上序列进行分段，用Biosun软件计算每一段序列的自由能. 获得的4条序列两两互为引物，每段长度在60 bp以内，便于合成.
　　1.2.4PCR合成第一轮，引物Scfvpns1与Scfvpna1配对，模板为4C13重链，PCR扩增产物为A; 引物Scfvpns2与Scfvpna2配对，模板为4C13轻链，PCR扩增产物为B；第二轮，分别以A， B为模板DNA，以Scfvpns1与Scfvpna2为引物，PCR扩增产物分别SVFV的全长基因序列. PCR 反应条件：95℃变性3 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，25个循环；72℃延伸7 min. DNA片段纯化按试剂盒说明书进行.
　　1.2.5基因转染待293T细胞长至40%~60%成片时，将溶液A和溶液B混匀，室温下置15 min（溶液A：2~5 μg DNA PEG 法纯化的质粒，1 μg/mL溶于水用100 μL无血清DMEM稀释. 溶液B：2~20 mL Lipofection 溶于100 μL无血清DMEM ）用无血清培养基2 mL洗细胞1次. 加800 mL无血清培养基到DNA混合物中，轻轻混匀，然后加入培养板中. 细胞于37℃ CO2孵箱中孵育6 h，去除培养基，再加2 mL含抗生素的完全培养基，放孵箱中. 孵育48 h收集上清检测蛋白质表达情况.

　　1.2.6抗ricin中和性单抗4C13 ScFv与ricin的结合活性检测竞争ELISA用2 mg/L ricin包被ELISA板并封闭. 取抗ricin中和性单抗4C13 ScFv真核细胞培养上清，加入到ELISA板中，每孔100 μL，于37℃温育1 h后， 用PBST洗板4次. 加入抗ricin中和性单抗4C13HRP，每孔50 μL. 再加入50 μL，于37℃温育45 min，PBST洗板4次，以TMB底物显色后，于波长450 nm测定吸光度（A）值.
　　1.2.7抗ricin中和性单抗4C13 ScFv中和活性检测 用RPMI1640 10% FCS 倍比稀释ricin，使其终浓度分别为2.5， 1.25， 0.63...... 0 ng/mL，加入96孔细胞培养板中50 μL/孔，分别加入ricin中和性单抗4C13 ScFv真核细胞培养上清50 μL/孔并混匀. 每孔加入100 μL浓度为2×105 /mL sp2/0细胞，同时设不加抗体培养上清只加ricin的细胞对照、不加ricin只加抗体培养上清的细胞对照和空白对照，每种培养上清重复3孔. 37℃含50 mL/L CO2的培养箱中培养24 h，离心，弃上清，每孔加入MTT（5 mg/mL）10 μL，继续孵育4 h. 离心，弃上清，每孔加入100 μL DMSO，振荡溶解结晶后570 nm比色测A值. 按下式计算各孔存活细胞百分率，间接反映ricin的细胞毒性. 细胞存活率%=［（实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值）］×100.
　　2结果
　　2．1蓖麻毒素中和性单抗杂交瘤细胞轻、重链基因的钓取 取对数生长期的中和性单抗4C13细胞，用TRIzol提取RNA，经RTPCR，用两对特异性引物Fd (PHs1+ PHa1) ；L (PLs1+PLa1)；扩增抗体的轻、重链基因（图1）. 并连入pGEMT Easy 载体，经筛选、酶切分析（图2）、序列分析、比对，编码序列为小鼠免疫球蛋白轻、重链基因，并成功的登陆到GenBank（登录号: DQ389248 和 DQ389245）.
　　
　　2．2基于中和性单抗的ScFv真核表达载体的构建本研究使用的信号肽序列插入位置为PCDNA3.1的多克隆位点. 第一轮PCR，引物ScFv pns1与ScFv pna1配对，模板为4C13重链；引物ScFv pns2与ScFv pna2配对，模板为4C13轻链，扩增出大小约为400 bp的片段（图3）；第二轮，分别以第一轮的产物为模板DNA，以ScFv pns1与ScFv pna2为引物，扩增出大小为750 bp的ScFv全长基因序列（图3）. 将构建好的重组质粒进行菌落PCR筛选及EcoRⅠ与HindⅢ双酶切，1 g/L琼脂糖凝胶电泳结果（图4）正确，DNA测序分析亦显示核苷酸序列正确.
　　2．3单链抗体的真核表达和生物学活性检测
　　2.3.1用竞争ELISA检测ScFv与ricin的结合用转染细胞的培养上清就ScFv的特异性进行了试验，结果显示:ScFv与ricin可特异性结合，抑制率%=(AantiricinHRP-AScFv)/AantiricinHRP×100. 培养上清原液和2倍稀释液的抑制率分别为33.7%和29%(图5).
　　2.3.2SCFV对ricin的中和实验ScFv 在ricin浓度为0.31~0.02 ng/mL时均不能中和 ricin 对SP2/0细胞的细胞毒，ScFv 在ricin浓度为0.01~0.005 ng/mL时可以中和ricin 对SP2/0细胞的细胞毒，在此范围内，随着ricin浓度的逐渐增大，细胞的存活率逐渐减低，呈现较好的浓度效应(图6).
　　3讨论
　　ricin几乎同所有真核细胞结合， 使核糖体蛋白失活，一分子ricin进入细胞，就足以使整个细胞蛋白质的合成停止而死亡，其毒性是氰化物的6000倍；在生物恐怖袭击中ricin可以气溶胶的形式进入体内，引起严重的肺泡炎症和肺水肿，袭击者最后因肺阻塞缺氧而导致死亡［3-4］.
　　大量研究表明：用ricin的中和抗体治疗突发性ricin中毒是可行的［5-11］，FurukawaStoffer等［5］报道：腹腔注射含ricin中和抗体的培养上清并同时注射0.5 μg ricin（致死剂量）后，可保护受试小鼠抵抗毒素攻击. 抗体治疗的成败依赖于ricin被吸收的多少和进入体内的路径. 在针对ricin活性链的单克隆抗体与毒素的分子比为4∶1时，抗体在体外可中和ricin对EL4淋巴瘤细胞的细胞毒作用. 上述成果为我们用中和性单抗防治蓖麻毒素中毒及研制基于单抗的其他拮抗剂奠定了理论和实践基础.

　　抗体的单链可变区片段（ScFv）由一弹性接头(linker )将抗体可变区重链 (VH) 和轻链 (VL)连接而成，是抗体具有抗原结合部位的最小功能结构单位. 以分子量小、体内半衰期短、免疫原性低、可在原核细胞系统表达、易于基因工程操作等特点而倍受关注. 恰当的选择V区方向、接头长度可构成具有不同大小、不同弹性、不同分子价的Fv分子，以满足体内诊断和治疗的目的. 由于IgG1在人血清中生物半衰期长（21 d）， Fc结合能力、补体活化及ADCC性质较好，目前在以临床治疗应用为主的抗体人源化中选择IgG1亚类进行改造［12］，我们构建的单抗4C13亚类为IgG1，恰好可用于基因工程改造.
　　
　　在本研究中我们选择了最常用的15肽Linker (GGGGS)3 ， V区的方向为VH linkerVL，选用本研究室构建的抗CEA单抗McAb Mt84.66的信号肽序列，在真核表达载体PCDNA3.1中进行了表达，表达产物与ricin显示出较好的结合特性. 就ScFv的中和活性而言，比亲本抗体4C13差很多，在IC50浓度的ricin作用下，ScFv对SP1/0细胞没有保护作用，不断降低ricin浓度，在ricin浓度为0.01~0.005 ng/mL时可以中和 ricin 对SP2/0细胞的细胞毒作用，在此范围内，ricin 作用SP2/0细胞后，随着ricin浓度的逐渐增大，细胞的存活率逐渐减低，呈现出较好的浓度效应. ScFv的稳定性、表达产量和空间构象形成中对抗体片段聚集的抵抗等因素及内部结构域效应都影响着抗体的功能. 由于轻链η可变区结构域非常不稳定，所以轻链免疫球蛋白类型特别是CDRL3对ScFv稳定性的影响尤为突出［13］. 实验结果的不太理想，可能与此有关. 下一步的工作将是在计算机分子模建的指导下提高ScFv小分子抗体的中和活性.
基金项目：国家高技术研究发展计划(863)（2002AA232021和2004AA002020）；中国博士后基金（2004035289）

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