关于野生型KLF6对前列腺癌LNCaP细胞的作用

　　　　　　　　作者：孙明　黄健　林天歆　庞健　廖勇彬　胡明　陈学中　　

【摘要】 目的： 探讨野生型抑癌基因KLF6对前列腺癌LNCaP细胞的生长增殖、细胞周期和侵袭转移能力的影响及其可能的作用机制. 方法： 利用RTPCR法克隆目的基因KLF6，并将含KLF6的pEGFPC1质粒转染入LNCaP细胞. 分为转染组和对照组分别进行MTT法观察LNCaP细胞的生长抑制率，流式细胞仪观察细胞周期比例变化和凋亡率，细胞爬片划痕法观察LNCaP细胞的侵袭转移能力变化. 结果： 转染了野生型抑癌基因KLF6的前列腺癌LNCaP细胞生长抑制率为(31.9±4.7)%，对照组为0%，差异有统计学意义（P&<0.01），细胞周期比例表现为G2/M期减少，G0/G1期比例增加为(75.0±8.8)%，对照组为(55.9±7.1)%， 差异有统计学意义（P&<0.05），细胞凋亡峰为(29.3±3.7)% ，对照组为(8.6±0.9)%， 差异有统计学意义（P&<0.01）；每毫米划痕区内迁移入的细胞数为102.8±15.4，对照组为（192.7±25.2）， 差异有统计学意义（P&<0.05）. 结论： 野生型抑癌基因KLF6的转染可以明显抑制前列腺癌LNCaP细胞的生长增殖， 并诱导其调亡，使其侵袭转移能力下降，其机制可能与野生型抑癌基因KLF6部分地逆转LNCaP细胞的恶性表型有关.
【关键词】 基因，肿瘤抑制；前列腺肿瘤；LNCaP；KLF6
　　【Abstract】 AIM: To observe the effect of wild type KLF6(wtKLF6) on proliferation，cell cycle，invasion and migration of prostate cancer cell line LNCaP by transgenic method. METHODS: WtKLF6 cDNA was obtained by RTPCR method from liver cell and inserted into plasmid pEGFPC1 for transfecting into LNCaP cells. The untransfected LNCaP cells served as the controls. MTT was used for observing the cell growth suppression， flow cytometer for apoptosis and cycle phase， invasion capability experiment for cell invasion capability with antioncogene wtKLF6 on prostate cancer cell line LNCaP by transgenic method for 48 h. RESULTS: After wtKLF6 was transfected into LNCaP cells， the growth suppression of LNCaP cells was enhanced ［(31.9±4.7)% vs 0%， P&<0.01］， the apoptosis was increased ［(29.3±3.7)% vs (8.6±0.9)%， P&<0.01］， the invasion capability was decreased［immigrated cell population/mm2， (102.8±15.4) vs（192.7±25.2）， P&<0.05］. WtKLF6 also decreased the ratio of LNCaP cell in phase G2/M， increased ratio of G0/G1 from control group(55.9±7.1)% to transfection group (75.0±8.8)% (P&<0.05). CONCLUSION: WtKLF6 transfection can suppress the growth and induce the apoptosis， decrease the invasive capability of LNCaP cells， probably by reversing partially its malignant phenotype.
　　【Keywords】 genes， tumor suppressor; prostatic， neoplasms; LNCaP; KLF6
　　0引言

　　新近发现抑癌基因KLF6 (Kruppellike factor 6)与前列腺癌的发病有密切关系，很可能前列腺癌的关键的“看门人（gatekeeper）”抑癌基因. 本实验即旨在研究将野生型抑癌基因KLF6转染入前列腺癌细胞系LNCaP后，观察其对LNCaP细胞生长增殖、细胞周期及侵袭转移能力的影响，并探求其可能的作用机制，以期为使用抑癌基因KLF6治疗激雄素依赖型前列腺癌提供实验和理论证据.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　目的基因cDNA的获得及载体构建按《分子克隆实验指南》方法从正常人肝组织细胞中提取RNA，按GenBank公布的野生型KLF6基因序列及文献设计引物序列: 5′端引物: 5′AAGGTACCATGGACGTGCTCCCTATGTGC3′；3′端引物:5′CGTCT
AGATCAGAGGTGCCTCTTCATGTG3′. RTPCR反应扩增获得KLF6基因外显子片段pKLF6. pKLF6用内切酶BamHI和EcoRI双酶切，真核表达载体pEGFPC1同样用BamHI和EcoRI双酶切，与pKLF6相连接，筛选出重组质粒pEGFPC1KLF6.

　　1.2方法
　　1.2.1质粒转染将5 μg的 pEGFPC1KLF6和10 μg的脂质体加入100 μL无血清培养液中，15 min后加入1.8 mL的无血清培养液中混匀，并加入处于对数生长期约5×106/mL的LNCaP细胞培养板中. 37℃， 50 mL/L CO2培养箱中转染1 h，再加入含100 mL/L新生小牛血清的完全培养液1 mL，在37℃， 50 mL/L CO2中继续培养. 转染后每天进行细胞计数及细胞排斥观察. 同时以pEGFPC1空载体转染的LNCaP细胞作为对照.

　　1.2.2阳性克隆细胞的筛选和培养荧光显微镜检查转染后的LNCaP细胞，并采用G418筛选获得含KLF6基因的阳性LNCaP克隆细胞，继续传代培养6 wk，收获细胞悬液或取其细胞爬片待用. 人前列腺癌LNCaP细胞及转染后的KLF6LNCaP细胞培养于含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液（Gibco公司）中，添加100 IU/mL青霉素及100 mg/L链霉素. 37℃， 50 mg/L CO2的条件下常规培养.
　　1.2.3噻唑蓝（MTT）法观察细胞生长抑制率将5×106/L的前列腺癌LNCaP细胞和转染KLF6后的LNCaP细胞接种于96孔板，每孔200 μL，贴壁生长48 h后，弃上清后，每孔加入200 μL新配制的5 g/L的MTT， 37℃继续孵育4 h，弃上清加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），混匀后于DG3022型酶标仪，在490 nm波长测定吸光度（A）. 细胞生长抑制率=（1-实验孔测定值/对照孔测定值）×100%. 重复实验3次，结果取平均值.

　　1.2.4流式细胞仪分析LNCaP细胞和转染后的KLF6LNCaP细胞，消化分离为1×106/mL的单细胞悬液，离心后用0.1 mol/L的PBS液洗涤3次，700 mL/L乙醇固定30 min， 10 g/L的Triton X100 10 mL处理10 min， 10 g/L的RNase 1 mL处理10 min， 2.5 g/L的碘化丙锭染色30 min，采用美国Coulter公司Elite ESP型流式细胞仪分析. 重复实验3次，结果取平均值.

　　1.2.5细胞迁移实验取处于对数生长期的转染前后的LNCaP细胞，制成单细胞悬液，按2×104个细胞/孔将细胞加入24孔细胞培养板，50 ml/L CO2条件下37℃孵育4～6 h，在约60%～80%融合的单层细胞表面划出一约2 mm无细胞的细痕. 用PBS漂洗3次以去除划下的细胞. 加入新鲜无血清培养液继续培养24 h后，显微镜下计数迁移到单位长度划痕区的细胞数. 每组做3复孔平行样.

　　统计学处理： 所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS 12.0统计软件进行处理，采用t检验，其中P&<0.05代表差异有统计学意义.
　　2结果
　　2.1PCR反应及质粒构建样本经过RTPCR反应，显示电泳在约852 bp位置出现条带，为KLF6的cDNA. KLF6pEGFPC1质粒载体构建完成后，酶切鉴定并测序，结果与已知序列一致.
　　2.2KLF6阳性克隆细胞的筛选荧光显微镜检查可见成功转染了pEGFPC1表达绿色荧光蛋白的阳性表达细胞，并采用G418筛选获得足够数量阳性克隆的含KLF6基因的LNCaP细胞，以KLF6基因引物进行RTPCR扩增出KLF6的cDNA证明转染成功.

　　2.3KLF6的表达对LNCaP细胞生长的抑制作用MTT法观察及细胞生长曲线显示，转染KLF6基因后的LNCaP细胞生长增殖受到明显的抑制，生长抑制率为(31.9±4.7)%，对照组为0% (P&<0.01）.

　　2.4细胞周期及DNA含量的变化流式细胞仪定量检测表明，转染野生型KLF6后的LNCaP细胞生长24 h时即有微弱的凋亡峰出现，48 h后出现较为明显的凋亡峰［Ap峰=(29.3±3.7)%］，与对照组(8.6±0.9)%比较差异有统计学意义（P&<0.01）. 转染野生型KLF6后48 h， G0/G1期细胞增加，S期和G2/M期细胞减少，转染野生型KLF6后的LNCaP细胞的细胞周期阻滞以G0/G1期为主，作用48 h组占(75.0±8.8)%，对照组为(55.9±7.1)%，差异有统计学意义（P&<0.01，表1). 表148 h转染抑癌基因KLF6对LNCaP细胞周期及DNA含量的影响 (略)
　　2.5细胞迁移能力变化转染野生型KLF6后的LNCaP细胞划痕后生长24 h，显微镜下计数迁移到每平方毫米划痕区的细胞数为102.8±15.4，未转染的对照组LNCaP细胞迁移到每平方毫米划痕区的细胞数为192.7±25.2，差异有统计学意义(P&<0.05).
　　3讨论
　　近来研究发现抑癌基因KLF6与前列腺癌的发病有密切关系，其在前列腺癌中的突变率高达77%，并且有高度前列腺癌组织特异性，其研究前景非常广阔［1］. Chen等［2］通过对高分级肿瘤和肿瘤移植组织、细胞系的研究发现，28%的高分级肿瘤中，29%的培养前列腺癌细胞系中存在KLF6的杂合子突变. 前列腺癌的病因学研究中，虽然抑癌基因的缺失或癌基因的过表达均有报道，但仍没有那个单基因被确定为主要的“看门人(gatekeeper)”基因，甚至著名的抑癌基因如p53， PTEN， kras等也都仅在晚期前列腺癌中起作用［3］.
　　KLF6是一个哺乳动物体内广泛表达的锌指转录因子，在机体内参与细胞的生长分化、生长相关的信号转导、细胞增殖、凋亡和血管生成等［4］. KLF6通过上调细胞周期依赖激酶抑制物p21的表达，p21阻止Rb蛋白的磷酸化，进而导致E2F不能激活调节细胞周期进展的关键基因［5］. p53主要通过激活和上调p21而发挥作用，而 p53的突变频率在前列腺癌中并不高，而且往往见于转移癌，那么KLF6是否可以解释这种非依赖p53的p21的激活，目前仍不明确. Narla等［4］认为KLF6很可能在前列腺癌中扮演类似p53在其他肿瘤中的关键的“看门人”抑癌基因的角色和作用.
　　肿瘤细胞的细胞周期缩短和恶性增殖是其危害机体的重要原因之一，也是恶性肿瘤细胞的基本特征之一，如何使肿瘤细胞的细胞周期变慢，使其恶性增殖特点逆转，成为治疗肿瘤的重要追求目标［6］. 本实验研究证实转染野生型抑癌基因KLF6后，雄激素依赖型前列腺癌LNCaP细胞的生长增殖能力受到了明显的抑制，G0/G1细胞周期内的细胞数目显著增加，说明显著阻止了前列腺癌LNCaP细胞的细胞周期进展，说明野生型KLF6可以部分地逆转前列腺癌LNCaP细胞的恶性增殖的表型，减缓其细胞周期进展，提示KLF6在前列腺癌的发生和进展方面扮演着关键性的作用，是前列腺癌病因和进展中的一个重要抑癌基因.
　　诱导使肿瘤细胞生长阻滞细胞周期中的某个稽查点（checkpoint），阻滞肿瘤细胞周期的进展，诱导恶性肿瘤细胞发生凋亡是治疗肿瘤的重要途径之一［7］. 本实验结果表明转染野生型抑癌基因KLF6后雄激素依赖型前列腺癌LNCaP细胞的细胞周期被阻滞在了G0/G1期，并且流式细胞检测出现了显著的LNCaP细胞的凋亡，说明野生型KLF6可以诱导使前列腺癌LNCaP细胞的细胞周期得到阻滞，诱导使其发生凋亡，减缓细胞增殖的速度，减少肿瘤细胞的数量. 提示野生型KLF6可用于激素依赖型前列腺癌的治疗，也提示KLF6在前列腺癌的发生和进展方面是一个重要的抑癌基因.
　　恶性肿瘤的侵袭与转移是其发生和演变过程中最危险的阶段，多数临床肿瘤死于晚期的侵袭转移及其并发症，因此控制肿瘤的侵袭与转移是当今研究的重要课题，降低恶性肿瘤细胞的侵袭转移能力可有效地阻止恶性肿瘤的临床进展，延长肿瘤患者的生存期［8］. 本实验研究证实转染野生型抑癌基因KLF6后体外培养的前列腺癌LNCaP细胞的侵袭能力明显下降，说明野生型KLF6可以使前列腺癌LNCaP细胞侵袭转移的恶性表型得到一定抑制，减缓前列腺癌的进展，提示KLF6可以用于激素依赖型前列腺癌的治疗.

参考文献

　　［1］Narla G， Heath KE， Reeves HL， et al. KLF6， a candidate tumor suppressor gene mutated in prostate cancer［J］. Science， 2001，294(5551):2563-2566.

　　［2］Chen C， Hyytinen ER， Sun X， et al. Deletion， mutation， and loss of expression of KLF6 in human prostate cancer［J］. Am J Pathol， 2003，162(4):1349-1354.

　　［3］Isaacs W， De marzo A， Nelson WG. Focus on prostate cancer［J］. Cancer Cell， 2002，2:113-116.

　　［4］Narla G， Friedman SL， Martignetti JA. Kruppel cripples prostate cancer: KLF6 progress and prospects［J］. Am J Pathol， 2003，162(4):1047-1052.

　　［5］Jeng YM， Hsu HC. KLF6， a putative tumor suppressor gene， is mutated in astrocytic gliomas［J］. Int J Cancer， 2003，105(5):625-629.

　　［6］Narla G， DiFeo A， Yao S. Targeted inhibition of the KLF6 splice variant， KLF6 SV1， suppresses prostate cancer cell growth and spread［J］. Cancer Res. 2005，65(13):5761-5768.

　　［7］Schwartz GK， Shah MA. Targeting the cell cycle: A new approach to cancer therapy［J］. J Clin Oncol， 2005，23(36):9408-9421.

　　［8］Chung LW， Baseman A， Assikis V， Zhau HE. Molecular insights into prostate cancer progression: The missing link of tumor microenvironment［J］. J Urol， 2005，173(1):10-20.

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