关于盘状结构域受体2胞外区在酵母系统中的融合表达、纯化和功能鉴定

　　　　　　　　 作者：陈健康　张伟　刘楠楠　刘利兵　田菲　铁茹

【摘要】 目的： 盘状结构域受体2（discoidin domain receptor2， DDR2）是一种与肿瘤细胞转移相关的蛋白酪氨酸激酶，研究DDR2在类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis， RA）软骨破坏和肿瘤转移中的作用. 方法： 在毕赤酵母中表达DDR2胞外区片段（不含信号肽和跨膜区，命名为DR），并将所表达的蛋白进行纯化和功能鉴定，以备将来用作DDR2的特异性阻断剂. 结果： 获得了两株较高表达HisDR融合蛋白的毕赤酵母克隆；其表达的蛋白质中可溶性部分约占全部融合蛋白的18%；经NiNTA(nitrictriacetic acid)柱纯化后，获得了纯度约90%以上的可溶性HisDR融合蛋白；竞争结合抑制实验显示，HisDR具有阻断和细胞表面天然DDR2受体结合的功能. 结论： 所表达的融合蛋白HisDR具有抑制天然DDR2功能的作用.
【关键词】 盘状结构域受体2：胞外区；基因表达；阻断剂
　　【Abstract】 AIM: To investigate the role of discoidin domain receptor 2 (DDR2) in the destruction of cartilage in rheumatoid arthritis (RA) and tumor metastasis. METHODS: We expressed extracellular domain of DDR2 fused with a His tag to increase protein solubility and facilitate purification (without signal peptide and transmembrane domain， designated DR) in Pichia pastoris， purified the expressed protein， and characterized its function， for the purpose of future application as a specific DDR2 antagonist. RESULTS: Two clones with relatively high expression of HisDR were obtained. After purification by a NiNTA (nitrictriacetic acid) chromatographic column， soluble fused HisDR with over 90% purity was obtained. Competitive binding inhibition assay demonstrated that the expressed HisDR could block the binding of DDR2 and natural DDR2 receptors on synovial cell surface. CONCLUSION: Extracellular domain of DDR2 fused with a His tag could block the binding of DDR2 and natural DDR2 receptors.
　　【Keywords】 discoidin domain receptor 2; extracellular domain; gene expression; blocker
　　0引言

　　盘状结构域受体(discoidin domain receptors，DDR2)是一类带有盘状结构域的受体型酪氨酸激酶，这类激酶在哺乳类动物体内有两种，分别为DDRl和DDR2［1］. 研究发现，这类激酶广泛分布，与某些肿瘤的转移相关，其中DDRl表达于肿瘤的组织细胞而DDR2表达于间质细胞［2-6］. 人关节滑膜组织也表达DDR2［7］. 对于DDR2，纤维性胶原，如I， Ⅱ和Ⅲ型胶原，是它的配体，胶原与DDR2的结合可上调细胞MMP1的表达［8］. 为了研究DR2在肿瘤转移和类风湿性关节炎中的作用，DDR2特异性阻断剂将是一个有力的工具. 但由于DDR2是一种比较新的分子，目前对它的研究又不多，所以尚无特异性的受体阻断剂. 可溶性受体作为特异性受体阻断剂已被广泛应用于多种受体的功能研究．甚至作为抑制剂进入临床治疗. 其机理是在细胞外，外源的模拟受体分子由于与天然受体结构相同而竞争性地与相应配体结合，从而阻断了配体与天然受体的结合，也就抑制了配体和受体相应的功能.
　　
　　我们采用此策略对DDR2胞外区用毕赤酵母系统进行了表达. 为了增加蛋白质的可溶性，选择了融合表达方式：采用pPIC3.5K载体，表达His融合蛋白. 融合蛋白经纯化后，通过竞争抑制实验验证其是否阻断配体II型胶原与细胞表面DDR2的结合，通过细胞实验验证其是否抑制II型胶原刺激下的细胞MMPl的分泌.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　重组质粒pRsetAddrg2由本室构建；pPIC3.5K酵母表达载体、酵母GS115菌种、氨基酸混合物、大肠杆菌E.coli Top 10 F购自 invitrogen公司；酵母氮碱（YNB）、酵母消解酶、酸洗玻璃珠、Tween20为Sigema公司产品；山梨醇、胶回收和质粒提取试剂盒为上海华舜生物技术公司产品；鼠抗6His mAb， NTA亲合介质购于Qiagen公司；HRP标记的羊抗鼠二抗购自Santa Cruz Biotechnology公司；Western发光底物为Pierce公司产品，NC膜购于Amersham公司.
　　1.2方法
　　1.2.1PCR引物设计pPIC3.5K的多克隆位点只有EcoRI和NotI适合ddrg2插入，考虑到Kozak序列（ACC ATG G）有利于外源基因在酵母中的表达，在6 His翻译起始码ATG上游引入ACC，又将ATG后的C碱基突变为G. 两条引物分别为：5′端为：5′ CGGAATTCACCATGGGGGGTTCTCATCATCATCAT 3′和3′端为：5′ CGGGCGGCCGCTTAAGTGTTGCTGTCATCAACTTTAAGCATTGG 3′.
　　1.2.2PCR产物回收、克隆及序列鉴定将PCR产物回收后直接与pMDl8T载体连接，转化大肠杆菌后挑克隆酶切鉴定，将鉴定正确的克隆送基康公司测序.
　　1.2.3DR片段在pPIC3.5K载体中的亚克隆大量提取重组T载体质粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的pPIC3.5K载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定.
　　1.2.4重组载体的酵母电转化取10 μL（约5 μg）SalⅠ单酶切线性化的pPIC3.5Kddr2重组质粒与80 μL酵母电转化感受态细胞混匀，转移于预冷的0.2 cm电转化杯，冰浴5 min. 电转化后（参数为1500 V， 25 μF， 200 Ω）立即加入500 μL预冷的1 mol/L山梨醇，混匀，铺于RDB板，30℃培养3~4 d. 以上过程同时做空载体对照.
1.2.5多拷贝整合重组酵母的筛选用2 mL的1 mol/L山梨醇收集所有酵母重组菌落后混匀，分别取100~200 μL铺于含G418分别为0， 0.5， 0.75， 1.0， 1.5， 2.0， 2.5， 3， 4， 5 mg/mL的YPD板上，30℃培养3~4 d.
　　1.2.6重组酵母菌落的PCR鉴定挑含G418浓度较高的YPD板上的单菌落于0.5 mL离心管中，加10 μL去离子水、5 μL 5 U/μL的酵母消解酶混匀，30℃温育10 min，再-70℃冻10 min. 冰融后作为PCR模板，PCR引物为pPIC3.5K载体多克隆位点两侧的引物：5′端为：5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC 3′；3′端为：5′GCAAATGGCATTCTGACATCC3′. PCR反应参数为：94℃ 30 s；56℃ 1 min；72℃ 90 s，30个循环.
　　1.2.7DDR2DR 蛋白的酵母诱导表达及鉴定挑多拷贝重组酵母单菌落于30 mL的MGY培养液中，30℃， 250 r/min培养18 h. 室温2500 r/min离心5 min，菌体重悬于300 mL的MM培养基中. 30℃培养3 d（期间每隔24 h加甲醇至5 g/L）后离心收菌，菌体沉淀用10 mL裂解液重悬后，加入等体积的酸洗玻璃珠剧烈振荡30 s；冰浴30 s，重复8次. 4℃高速离心10 min，上清为裂菌液. 取15 μL裂菌液进行SDSPAGE和Western Blot鉴定表达.
　　1.2.8DDR2DR蛋白的亲合纯化用10 mL洗涤液平衡NTANi2+柱，将裂菌液上样. 用5 mL Lysis缓冲液洗柱，再用15 mL Washing缓冲液洗柱，用3 mL Elution缓冲液洗脱DDRG2蛋白，收集洗脱液，0.5 mL/管.
　　1.2.9竞争结合抑制实验包被RA细胞于96孔板上，在40 g/L多聚甲醛中固定24 h：PBS洗涤5 min共3次. 加入倍比稀释的HisDR溶液. 空白对照为His纯化蛋白质洗脱液（内无蛋白质），阴性对照为His纯化蛋白质(用pRSETA空载体转化大肠杆菌表达和纯化得到)，浓度为0.1 mg/L，各孔加入等量的II型胶原(不溶型，超声打散)的PBS液，37℃温育1 h：PBS洗涤5 min共3次：加入抗Ⅱ型胶原抗体，37℃温育1 h： PBS洗涤5 min共3次. 加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃温育0.5 h. PBS洗涤5 min共3次. 加入ABTS显色液显色. 在ELISA仪上检测A410的吸光度.
　　2结果
　　2.1DDR2胞外区片段DR的PCR扩增、克隆和序列分析10 g/L琼脂糖电泳显示，PCR产物为约1.3 kb的特异性片段，将此条带回收，即与pMDl8T载体连接，酶切鉴定后，对其中一个阳性克隆进行测序，并将序列在GenBank中进行分析，结果显示，序列完全正确. 图1显示，PCR产物和重组pMDl8T载体酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果.
　　2.2重组酵母表达载体pPIC3.5KDR的构建及鉴定大量提取重组pMDl8T载体质粒，用EcoRI和NotI酶切出目的片段后，连入用同样方法处理的pPIC3.5K载体，转化大肠杆菌后提取质粒，进行酶切鉴定. 图2显示，重组pPIC3.5KDR载体的琼脂糖凝胶电泳结果.
　　2.3重组酵母菌的筛选和PCR鉴定酵母电转化后每个RBD板上约长出5×103个His阳性单菌落，G418浓度筛选最高为4.0 mg/mL，根据同源重组一个载体约抵抗0.25 mg/mL G418估算，同源重组入同一酵母菌的pPIC3.5K ddrg2串联拷贝数最高可达到15个以上. 图3显示，重组酵母菌的PCR鉴定结果.
　　2.4DR蛋白的表达和鉴定对PCR鉴定后的3号和4号重组菌进行目的蛋白质的诱导表达，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，3， 4号阳性克隆细菌在约46 ku处均有一新生表达条带（HisDR），与目的蛋白质大小相符（图4）. 根据薄层扫描结果分析，上清中的新生蛋白质约占融合蛋白质总量的18％. WesternBlot验证结果显示：6 HisDDRG2胞外区蛋白DR在毕赤酵母中可以表达，且为可溶性表达（图5).

　　2.5HisDR蛋白的纯化利用NiNTA agarose柱通过金属螯合亲合层析进行纯化，从酵母表达菌体的裂菌液上清中纯化出了天然可溶形式的6 His融合DR蛋白. 本实验中，洗脱液中含有目的蛋白质，薄层扫描分析显示，目的蛋白质纯度达90.5％（图6）. 通过蛋白质定量，计算可溶性目的产物的得量约为400 μg/L细菌(结果未列出).
　　2.6HisDR对II型胶原与DDR2结合的竞争抑制功能我们摸索了在不同Ⅱ型胶原浓度(2.5 mg/L，0.25 mg/L，0.025 mg/L)下，梯度浓度(0.4mg/L，1∶10；1∶100；1∶200；1∶400；1∶800；1∶1 600；1∶3200；1∶6 400；1∶12 800；1∶25 600)的HisDR蛋白对胶原结合于细胞表面DDR2的影响. 这里II型胶原为不溶型的，反应时悬浮于PBS中. 结果显示(图7)，对于胶原0.025 mg/L组，加入His纯化的其他蛋白做对照的孔显色最深，说明His纯化的其他蛋白无封闭II型胶原与细胞表面DDR2结合的功能；对于HisDR孔，从0.4 mg/L～l∶800范围内，基本无显色，说明HisDR可以完全封闭II型胶原与DDR2的结合；从1∶1600开始有显色，1∶3 200~1∶25 600显色逐渐加深，说明HisDR的存在可以竞争抑制II型胶原与细胞表面DDR2的结合. 表达的HisDR融合蛋白在体外可以与II型胶原结合，起到竞争抑制DDR2受体的作用.
　　3讨论
　　DDRs是一类受体型蛋白酪氨酸激酶，由于其胞外区含有一个类似盘基网柄菌（discoidin）凝集素盘状结构I的DR结构，而被称为DDRs. DDR2广泛表达于多种组织，这种广泛又有选择性的分布提示，DDR2的功能是重要且特异的［1］.
　　原位杂交显示，在肺癌和卵巢癌中，DDR2在癌细胞周围间质细胞高表达，提示DDR2在肿瘤发展中具有作用，可能肿瘤细胞转化后的侵袭和转移特性由DDR2介导，因为恶性细胞突破组织屏障需要破坏胞外基质［8］. 其他能降解基质的人类疾病如肺纤维化、肝硬化、骨硬化病和类风湿关节炎可能都存在DDR2的表达和信号转导过程，推测DDR2的一个重要功能可能是通过调节胶原的合成和降解来控制胶原性胞外基质水平. 若能找到阻断DDR2作用的分子，则可能有助于预防肿瘤细胞的转移和减轻类风湿性关节炎的软骨破坏［9］.
　　由于目前尚不清楚DDR2胞外区与配体胶原结合的具体部位，我们选择了DDR2胞外区全长含399个氨基酸的片段来表达，作为阻断剂. 在以往研究DDR2胞外区功能的时候，我们也曾构建了几种GST和6 His融合的DDRG2胞外区原核表达载体（4T1Ddrg2和pRsetADdrg2），但它们的表达形式无一例外均是包涵体. 利用包涵体的变性和复性进行纯化，效果都不理想. 又考虑到变性和复性会影响DDRG2胞外区的结构与活性，于是我们便尝试在毕赤酵母中表达DDRG2胞外区蛋白.
　　毕赤酵母表达系统是比较新的酵母外源蛋白表达系统. 毕赤酵母表达质粒通过同源重组整合入酵母基因组而随同酵母染色体一起复制. 同源重组时，毕赤酵母表达质粒可以通过体内和体外两种方式多拷贝整合于毕赤酵母基因组中. 由于不同的基因具有不同的特性，在毕赤酵母中表达时，不同外源蛋白的表达水平可能会有很大的差异. 我们的实验表明，DDR2DR在毕赤酵母表达系统中获得了表达，表达产物经过纯化后得到了纯度约为90.5％的融合蛋白. 竞争结合实验表明，融合蛋白HisDR在0.2 μg/L的浓度下能完全阻断II型胶原与细胞表面天然DDR2的结合. 虽然不能完全阻断，但仍可以说明两个问题：一是NIH 3T3细胞和RA滑膜细胞中的DDR2介导MMP1的表达或过表达；二是可溶性DDR2受体胞外区作为阻断剂，可以在一定程度下抑制这种表达.

参考文献

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